張碩 沈泳 高秀飛 謝小紅

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類內(nèi)源性非編碼且以單鏈形式存在的RNA，通過(guò)互補(bǔ)配對(duì)至靶mRNA 的3′UTR，形成RNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合物，可以降解靶標(biāo)mRNA 或者抑制mRNA 翻譯。Let-7 是發(fā)現(xiàn)最早的一種miRNA，家族基因在多種癌癥中扮演著抑癌基因的角色，如Let-7c-5p 能夠負(fù)調(diào)控Myc、HMGA2 以及BclxL 等具有致癌作用的基因，抑制前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[1]、肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲以及結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移等[2-3]。Let-7c-5p 在乳腺癌患者血清中的表達(dá)水平明顯低于正常人，在乳腺癌組織中，也呈低表達(dá)[4]。并且在雌激素受體-α（estrogen receptor-α，ER-α）呈陽(yáng)性的乳腺癌患者中，表達(dá)水平相對(duì)較高的患者預(yù)后更好[5]，這意味著let-7c-5p在乳腺癌中很可能也是作為腫瘤抑制因子而存在。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是指長(zhǎng)度超過(guò)200 個(gè)核苷酸且不編碼蛋白質(zhì)的RNA，是基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要組成部分，異常表達(dá)會(huì)擾亂基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育損傷或神經(jīng)功能障礙[6]，還與許多疾病甚至腫瘤具有相關(guān)性[7]。漿細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)化遷移基因1（plasmacytoma variant translocation 1，PVT1）位于人類第8 號(hào)染色體上，已在多種癌癥中被證實(shí)扮演癌基因的角色[8]。TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中近2500 例乳腺癌患者的基因芯片結(jié)果顯示，22%的患者PVT1 呈現(xiàn)基因拷貝數(shù)擴(kuò)增趨勢(shì)，總生存率明顯低于基因拷貝數(shù)未發(fā)生改變者，表明在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起了重要的致癌作用[9-10]。競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA 學(xué)說(shuō)認(rèn)為lncRNA 上有miRNA 的結(jié)合位點(diǎn)，可以作為miRNA 的靶標(biāo)來(lái)吸收miRNA，從而減弱miRNA 對(duì)靶mRNA 的抑制作用。本研究探索在乳腺癌中l(wèi)ncRNA 漿細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)化遷移基因1（PVT1）是否為let-7c-5p 的靶標(biāo)基因，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7 購(gòu)自于上海市中科院細(xì)胞庫(kù)。E.coli DH5α 和反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自Takara 寶生物工程（大連）有限公司（批號(hào)：D9057、RR014A）；pRL-TK 載體質(zhì)粒、pGL3 對(duì)照質(zhì)粒以及雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega 公司（批號(hào)：E2241、E1751、E1910）；SanPrep 柱式DNA 割膠回收試劑盒購(gòu)自美國(guó)Axygen 公司（批號(hào)：AP-GX-50）；細(xì)胞RNA 提取試劑盒DNA/RNA/Protein Isolation Kit 購(gòu)自美國(guó)Omega Bio-tek 公司（批號(hào)：R6734-01）；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司（批號(hào)：10100-147）；DMEM 高糖培養(yǎng)基購(gòu)自杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司（批號(hào)：GNM12800）；細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Biomiga 公司（批號(hào)：GT1211-02）；let-7c-5p mimics 以及對(duì)照miR-NC mimics 于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司定制。

1.2 方法

1.2.1 乳腺癌中PVT1 表達(dá)水平檢測(cè) 為明確PVT1 在乳腺癌中的作用，使用cBioPortal 數(shù)據(jù)庫(kù)[9-10]對(duì)TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的1097 例乳腺癌患者的1100 例標(biāo)本中l(wèi)ncRNA PVT1 表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)掘出PVT1 異常表達(dá)的患者數(shù)，進(jìn)一步使用UALCAN 數(shù)據(jù)庫(kù)[11]對(duì)患者癌變組織中PVT1 表達(dá)水平與正常組織中PVT1 的表達(dá)量進(jìn)行比較。

1.2.2 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)作用位點(diǎn) 利用RNAhybrid[12]和RegRNA[13]軟件預(yù)測(cè)PVT1 序列上let-7c-5p 的結(jié)合位點(diǎn)，綜合兩個(gè)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果選取目的結(jié)合位點(diǎn)。

1.2.3 總RNA 的提取及目的產(chǎn)物擴(kuò)增 MCF-7 細(xì)胞采用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，使用DNA/RNA/Protein Isolation Kit 試劑盒提取總RNA，提取步驟參照說(shuō)明書。PVT1 原序列PVT1（Pw）擴(kuò)增引物如下：上游引物5′-GCTCTAGAATCTTCAGTGGTCTGGGGAATAACG-3′，下游引物5′- ATAAGAATGCGGCCGCCTCTCTCCAAATCTCAGTGTC-3′，其中上游引物5′端增加X(jué)baⅠ酶切位點(diǎn)及其保護(hù)堿基，下游引物5′端增加NotⅠ酶切位點(diǎn)及其保護(hù)堿基。采用重疊延伸PCR 敲除結(jié)合位點(diǎn)序列，從而擴(kuò)增得到PVT1 突變序列（Pm）。結(jié)合位點(diǎn)上游序列Pm1 的上游引物與Pw 相同，下游引物5′- CACCTCGGGACCTAGCTGAGCG-3′；結(jié)合位點(diǎn)下游序列Pm2 的上游引物5′-GCTCAGATGGGTCCCGAGGTGCG-3′，下游引物與Pw 相同。以Pm1 和Pm2為混合模板擴(kuò)增Pm，引物與Pw 引物一致。

取500ng 總RNA，以Pw 的下游引物為特異引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，反應(yīng)條件為42℃60min，70℃15min。取2μl cDNA 作為為模板，采用20μl 體系擴(kuò)增Pm1、Pm2、Pm 和Pw。Pm1 和Pm2 擴(kuò)增反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性3min；95℃30s，65℃30s，72℃20s，34 個(gè)循環(huán)，72℃5min；Pw 和Pm 擴(kuò)增反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性3min；95℃ 30s，65℃ 30s，72℃ 30s，34 個(gè) 循 環(huán)，72℃5min。

1.2.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 對(duì)Pw、Pm 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，割膠回收使用SanPrep 柱式DNA 割膠回收試劑盒。取割膠回收產(chǎn)物以及pRL-TK 載體質(zhì)粒進(jìn)行XbaⅠ和NotⅠ雙酶切，將雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳并回收。目的片段與載體質(zhì)粒摩爾比7∶1，16℃連接過(guò)夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α 中，涂布于含氨芐青霉素的LB 固體培養(yǎng)基，倒置培養(yǎng)12h，挑取單菌落進(jìn)行搖床培養(yǎng)。12h 后收集菌體，提取質(zhì)粒，進(jìn)行XbaⅠ和NotⅠ雙酶切驗(yàn)證，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及檢測(cè) MCF-7 細(xì)胞培養(yǎng)同1.2.3。提取對(duì)照質(zhì)粒pGL3、重組質(zhì)粒pRL-TK-Pw 和pRL-TKPm。分為3 組進(jìn)行轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)組：pGL3、pRL-TK-Pw、let-7c-5p mimics；對(duì)照組1：pGL3、pRL-TK-Pw、miR-NC mimics；對(duì)照組2：pGL3、pRL-TK-Pm、let-7c-5p mimics。每組共轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒40ng，重組質(zhì)粒800ng，mimics終濃度為20nmol/L，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。48h 后裂解細(xì)胞，使用雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)?；瘜W(xué)發(fā)光儀測(cè)出各孔數(shù)據(jù)后減去空白孔的基底信號(hào)，以pGL3 質(zhì)粒所發(fā)的螢火蟲熒光信號(hào)為對(duì)照，重組質(zhì)粒pRL-TK-Pw 以及pRL-TK-Pm 所發(fā)的海腎熒光信號(hào)除以螢火蟲熒光信號(hào)為相對(duì)熒光活性，對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌中PVT1 表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果1097 例乳腺癌患者中，21%的患者檢測(cè)出了PVT1 異常高表達(dá)，而這1097 例患者中PVT1 表達(dá)水平顯著高于114 例對(duì)照組樣本中的表達(dá)量（P＜0.001），見圖1。

圖1 乳腺癌患者中PVT1 表達(dá)情況（a：PVT1 在21%的乳腺癌患者中高度表達(dá)；b：乳腺癌和正常樣本中PVT1 的表達(dá)）

2.2 結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果RNAhybrid 軟件預(yù)測(cè)顯示PVT1 上614～636nt 為let-7c-5p 結(jié)合位點(diǎn)，見圖2a；RegRNA 軟件預(yù)測(cè)顯示607～629nt 為結(jié)合位點(diǎn)，見圖2b。綜合兩個(gè)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果，從原序列上敲除607～636nt 來(lái)構(gòu)建突變序列。

圖2 PVT1 序列上let-7c-5p 的潛在結(jié)合位點(diǎn)（a：RNAhybrid 預(yù)測(cè)的結(jié)合位點(diǎn)；b：RegRNA 預(yù)測(cè)的結(jié)合位點(diǎn)。）

2.3 目的產(chǎn)物PCR結(jié)果對(duì)Pm1、Pm2、Pm 和Pw 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果如圖3 所示。Pw 長(zhǎng)度為493bp，Pm1 長(zhǎng)度為310bp，Pm2 長(zhǎng)度為174bp，Pm長(zhǎng)度為463bp。對(duì)于條帶不單一的產(chǎn)物，利用割膠回收的方法獲得目的片段，再以此為模板進(jìn)行二次PCR。

圖3 PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果（a：Pw；b：Pm1；c：Pm2；d：Pm。M：DNA marker）

2.4 重組質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果對(duì)Pw、Pm 以及pRL-TK 載體質(zhì)粒進(jìn)行XbaⅠ和NotⅠ雙酶切，再進(jìn)行電泳并回收目的條帶，pRL-TK 載體雙酶切產(chǎn)物為4039bp，Pw 和Pm 雙酶切產(chǎn)物分別為469bp 和439bp，見圖4。連接后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含氨芐青霉素LB 固體培養(yǎng)基，12h 后挑取單菌落進(jìn)行搖床培養(yǎng)。收集菌體，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證及測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果表明結(jié)合位點(diǎn)序列敲除成功。雙酶切驗(yàn)證結(jié)果見圖5。

圖4 pRL-TK 雙酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果（a：pRL-TK 載體雙酶切電泳結(jié)果，M：1kb DNA ladder，1：pRL-TK 載體雙酶切產(chǎn)物；b：Pw 和Pm 雙酶切產(chǎn)物，M：DL500 DNA Marker，1：Pw 酶切產(chǎn)物；2：Pm 酶切產(chǎn)物）

圖5 重組質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證結(jié)果（M1：DL500 DNA Marker；M2：1kb DNAladder；1、2：pRL-TK-Pm 酶切產(chǎn)物；3、4：pRL-TK-Pw 酶切產(chǎn)物）

2.5 雙熒光素酶活性分析 分析結(jié)果顯示，對(duì)照組1中轉(zhuǎn)染對(duì)照基因miR-NC mimics 后，pRL-TK-Pw 的熒光活性正常，并未受到抑制；而實(shí)驗(yàn)組中轉(zhuǎn)染let-7c-5p mimics 后，pRL-TK-Pw 的熒光活性受到了明顯的抑制，降至對(duì)照組1 的62%（P=0.002），表明PVT1 原序列上存在let-7c-5p 的結(jié)合位點(diǎn)。對(duì)照組2 中共轉(zhuǎn)染let-7c-5p mimics 和pRL-TK-Pm 后，pRL-TK-Pm 的活性未受到抑制，表明結(jié)合位點(diǎn)被成功敲除，也進(jìn)一步說(shuō)明PVT1為let-7c-5p 的靶基因，見圖6。

圖6 雙熒光素酶活性分析（注：與對(duì)照組1 比較，**P＜0.01）

3 討論

2011 年Salmena 等[14]提出競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA 假說(shuō)，表明lncRNA 上存在miRNA 結(jié)合位點(diǎn)，可以與mRNA競(jìng)爭(zhēng)miRNA，從而形成一個(gè)大規(guī)模的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，而該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)存在一定穩(wěn)定性，穩(wěn)定性被破壞則會(huì)引起疾病甚至腫瘤的發(fā)生。近年來(lái)，大量研究證實(shí)了競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA 的調(diào)控機(jī)制，如癌基因lncRNA H19 在結(jié)直腸癌中過(guò)度表達(dá)能夠促進(jìn)結(jié)直腸上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化，使上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有活動(dòng)能力的間質(zhì)細(xì)胞，并獲得侵襲和遷移能力，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)H19 可以通過(guò)其序列中的miRNA 結(jié)合位點(diǎn)來(lái)結(jié)合miR-200a，從而減弱miR-200a 對(duì)其靶基因E 盒結(jié)合鋅指蛋白1（zinc finger E-box-binding protein 1，ZEB1）和ZEB2 的抑制作用，而ZEB1 和ZEB2 是上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)因子，可見H19 可以以競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA 形式發(fā)揮致癌作用[15]。競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA 的提出更加全面地闡明了疾病或者癌癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程中基因間的相互作用，也證明非編碼RNA 的存在并不是無(wú)意義的，它們可以通過(guò)多種方式影響mRNA的表達(dá)或翻譯，從而調(diào)控生物學(xué)行為。

研究表明，lncRNA PVT1 具有致癌作用，其在胃癌組織中的表達(dá)量顯著高于對(duì)應(yīng)的癌旁組織，其高表達(dá)與患者的腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移情況呈正相關(guān)，PVT1 的高表達(dá)常常意味著較差的預(yù)后，在胃癌細(xì)胞中干擾其表達(dá)能夠有效地抑制胃癌細(xì)胞增殖并且能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[16]。Zhang 等[17]還發(fā)現(xiàn)，PVT1 在胃癌中高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致順鉑耐藥的產(chǎn)生，明顯干擾治療效果。在非小細(xì)胞肺癌中也發(fā)現(xiàn)PVT1 表達(dá)呈上調(diào)趨勢(shì)，且其表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移緊密相關(guān)，在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中干擾PVT1的表達(dá)，則細(xì)胞增殖、侵襲以及遷移能力均受到抑制[18]。另外，PVT1 高表達(dá)的胰腺癌患者具有更短的總生存期[19]。Ergun 等[20]研究還證實(shí)，PVT1 可以通過(guò)抑制細(xì)胞正常凋亡來(lái)促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生。在本研究中通過(guò)cBio-Portal 和UALCAN 數(shù)據(jù)庫(kù)探索大量乳腺癌樣本中PVT1的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)超過(guò)20%的乳腺癌患者中PVT1 呈異常高表達(dá)，且乳腺癌組織中PVT1 的表達(dá)量明顯高于對(duì)照的正常組織，意味著在乳腺癌中PVT1 很可能也扮演著致癌基因的角色，且其具有成為乳腺癌診斷的生物標(biāo)志物的潛力。

既往研究表明，抑癌基因let-7 家族成員let-7c-5p在乳腺癌患者血清和乳腺癌組織中的表達(dá)量均低于正常對(duì)照樣本中，且提高let-7c-5p 的表達(dá)量會(huì)抑制乳腺癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，表明let-7c-5p 在乳腺癌中具有抑癌作用[4，21]。結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA 假說(shuō)，筆者推測(cè)致癌基因PVT1 可能為let-7c-5p 的靶標(biāo)基因，通過(guò)軟件預(yù)測(cè)出PVT1 序列上let-7c-5p 的結(jié)合位點(diǎn)，并應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果顯示let-7c-5p 能夠抑制含PVT1 原序列的熒光素酶載體活性，但對(duì)含PVT1 突變序列的熒光素酶載體活性則無(wú)抑制作用，該結(jié)果證實(shí)了PVT1 為let-7c-5p 的靶標(biāo)基因。筆者由此推論出PVT1 可以與let-7c-5p 的靶mRNA 競(jìng)爭(zhēng)，從而保護(hù)靶mRNA 免受降解或抑制，所以PVT1 的高表達(dá)能夠造成let-7c-5p 抑癌能力的下降，該研究結(jié)果表明在乳腺癌中l(wèi)ncRNA PVT1 可以以競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA 的角色發(fā)揮作用。

本實(shí)驗(yàn)中采用了最典型的MCF-7 細(xì)胞作為模式細(xì)胞進(jìn)行研究，進(jìn)一步研究還需要在更多乳腺癌細(xì)胞中對(duì)該機(jī)制進(jìn)行驗(yàn)證。此外，每個(gè)lncRNA 都能夠結(jié)合多個(gè)miRNA，每個(gè)miRNA 也能被多個(gè)lncRNA 結(jié)合，本研究只是探究了其中的一小部分，乳腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中相關(guān)基因間的相互作用機(jī)制仍然需要被繼續(xù)深入探索，才能為乳腺癌的早期診斷、靶點(diǎn)治療、基因治療以及更好的預(yù)后等提供更加有力的基礎(chǔ)依據(jù)。