王璐 傅力

天津醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院康復(fù)醫(yī)學(xué)系（天津300070）

葡萄糖是維持肌肉收縮的重要能量來源，機(jī)體葡萄糖代謝穩(wěn)態(tài)的維持對于人體健康至關(guān)重要。上世紀(jì)20年代至30年代，諸多應(yīng)用生理學(xué)研究均證實葡萄糖作為人類耐力運動能源的重要意義以及與低血糖和疲勞之間的關(guān)聯(lián)性[1]。葡萄糖轉(zhuǎn)運體包括以主動方式進(jìn)行逆轉(zhuǎn)運的鈉-葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白（sodium glucose cotransporter，SGLT）和以易化擴(kuò)散方式進(jìn)行轉(zhuǎn)運的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白（glucose transporter，GLUT）[2]兩類。GLUT4作為葡萄糖轉(zhuǎn)運體家族的成員，含有12個跨膜結(jié)構(gòu)蛋白[3]，能夠轉(zhuǎn)移并定位在細(xì)胞膜上進(jìn)而促進(jìn)葡萄糖的吸收，在骨骼肌葡萄糖轉(zhuǎn)運和代謝過程中發(fā)揮重要作用[4]。因此，深入探究GLUT4對骨骼肌細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運進(jìn)行調(diào)控的潛在機(jī)制將有助于為今后胰島素抵抗、糖尿病等疾病的治療提供新思路。

1 運動刺激骨骼肌GLUT4轉(zhuǎn)位的潛在機(jī)制

1.1 TBC1D1/4與GLUT4轉(zhuǎn)位

TBC1D1（Tre-2/BUB2/cdc1 domain family 1）和TBC1D4（Akt Substrate of 160 kDa，AS160）都是存在于骨骼肌細(xì)胞內(nèi)的GTP 酶激活蛋白（Rab-GTPase activating proteins，Rab-GAP）。TBC1D1/4 具有一些相同的重要特征，如：一個鈣調(diào)蛋白結(jié)合域（calmodulin-binding domain，CBD）和兩個磷酸酪氨酸結(jié)合域（phosphotyrosine-binding domains，PTB）。目前研究顯示：有氧運動通過激活一磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）使TBC1D1，TBC1D4 發(fā)生磷酸化，進(jìn)而促使GLUT4 囊泡從胞漿轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜上，促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞對葡萄糖轉(zhuǎn)運和攝取[5]。另一方面，TBC1D1/4也可通過調(diào)節(jié)AMPK 對GLUT4 和葡萄糖的轉(zhuǎn)運作用產(chǎn)生影響[6]。需要注意的是，在小鼠及人類骨骼肌細(xì)胞，有氧運動通過不同的AMPK三聚體促使TBC1D1/4磷酸化——對TBC1D1發(fā)揮磷酸化作用的是AMPKα2/β2/γ3三聚體[7]；對TBC1D4發(fā)揮磷酸化作用的是AMPKα2/β2/γ1三聚體[8]。

在有氧運動狀態(tài)下，骨骼肌細(xì)胞TBC1D1/4被認(rèn)為是以相同的方式作用于GLUT4 囊泡，進(jìn)而調(diào)控骨骼肌葡萄糖轉(zhuǎn)運。先前的研究顯示TBC1D1/4 可能是通過以下幾種途徑調(diào)控GLUT4 的轉(zhuǎn)位：1）影響GAP（GTPase activating protein，GTP 酶激活蛋白）活性：骨骼肌細(xì)胞中與葡萄糖轉(zhuǎn)運相關(guān)的Rab GTPases 主要包括Rab2、Rab8、Rab10、Rab14，胞漿中的Rab 蛋白能夠通過與GTP結(jié)合的活化途徑或者與GDP結(jié)合的失活途徑來調(diào)控GLUT4囊泡的轉(zhuǎn)位[9]。在運動刺激下，AMPK激活使得TBC1D1/4發(fā)生磷酸化而喪失了GAP活性，促使GLUT4囊泡轉(zhuǎn)位至細(xì)胞膜進(jìn)而增加轉(zhuǎn)載入細(xì)胞的葡萄糖，即骨骼肌對葡萄糖攝取增加；另一方面，GAP 活性的喪失會加速GLUT4 溶酶體的降解[10]；2）促使GLUT4儲存囊泡（GLUT4 storage vesicles，GSV）結(jié)合：TBC1D1/4能夠直接與GSV內(nèi)容物結(jié)合，包括胰島素調(diào)節(jié)性氨肽酶（insulin- regulated amino peptidase，IRAP）和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1（LDL receptor- related protein 1，LRP1）等，這種相互作用在胰島素作用下會相應(yīng)減少；3）TBC1D1-Ser231 位點發(fā)生磷酸化或與14-3-3蛋白相結(jié)合：主要能夠在AMPK 介導(dǎo)的骨骼肌葡萄糖攝取中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[10]。

1.2 RAC1與GLUT4轉(zhuǎn)位

Rho家族性GTPase的RAC1，作為運動刺激骨骼肌葡萄糖攝取調(diào)控中可能包含的多種牽伸刺激激活通路中的一種可能，通常是受被動拉伸刺激而激活。在胰島素和運動所激活的葡萄糖轉(zhuǎn)運中，Rac1 的參與是必須的，而在AICAR（5-Aminoimidazole-4-carboxamide -1-β-D-ribofuranoside）所激活的葡萄糖轉(zhuǎn)運中，Rac1則不是必須的。Rac1對于胰島素和運動所激活的細(xì)胞內(nèi)葡萄糖轉(zhuǎn)運是必需的，而在AICAR-激活的葡萄糖轉(zhuǎn)運過程中并不發(fā)揮作用[6]。先前的研究也提示：在嚙齒類動物和人類中，作為RAC1 下游靶點的p21-activated kinase（PAK）也會受運動的調(diào)控[11]。研究還證實：使用藥物抑制RAC1同時敲除編碼該蛋白的基因，運動刺激引起的葡萄糖轉(zhuǎn)運會減少30%～40%[12]。這些發(fā)現(xiàn)都證實了RAC1 在調(diào)控運動中機(jī)械刺激所引起的GLUT4 轉(zhuǎn)位和葡萄糖攝取中起到了關(guān)鍵作用。RAC1介導(dǎo)的潛在機(jī)制目前至少存在以下三種：（1）RAC1 調(diào)控肌動蛋白細(xì)胞骨架的重構(gòu)；（2）RAC1 可能通過激活另一種GTPase 相關(guān)蛋白（RALA）來促進(jìn)骨骼肌中GLUT4的轉(zhuǎn)位。盡管RALA是否能被肌肉收縮或被動牽伸刺激所直接激活還有待研究，但研究已經(jīng)證實此中介蛋白能夠調(diào)控胰島素刺激的RAC1 依賴性GLUT4轉(zhuǎn)位[13，14]；（3）RAC1是過氧化物產(chǎn)生的NADPH 氧化酶（NOX2）復(fù)合物的一個亞單位，也是激活NOX2 所必需的[15]。此氧化酶也能夠調(diào)控骨骼肌的葡萄糖轉(zhuǎn)運[16]。

值得注意的是，在調(diào)控運動刺激所引起的骨骼肌細(xì)胞葡萄糖攝取方面，TBC1D1 可能比TBC1D4 的作用更強(qiáng)，這是因為TBC1D1不僅含有幾個運動反應(yīng)性磷酸化位點，還有AICAR 反應(yīng)性磷酸化位點。目前有研究發(fā)現(xiàn)TBC1D1 上的三種不同位點（Ser237，Ser660，Thr596）在依賴AMPK 信號途徑的運動刺激下會出現(xiàn)相應(yīng)的磷酸化水平增加[17]。此外，有研究顯示：TBC1D1和TBC1D4的多個調(diào)控節(jié)點能夠協(xié)同于胰島素、運動或者兩者結(jié)合所刺激的GLUT4 傳輸釋放中[17]。當(dāng)兩種Rab-GAPs 都存在時，TBC1D1 在功能上主導(dǎo)TBC1D4，同時刺激誘發(fā)的GLUT4釋放主要依賴于TBC1D1介導(dǎo)的刺激，例如AICAR 和細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量；而TBC1D4 能夠調(diào)控由TBC1D1介導(dǎo)的GLUT4釋放對外部刺激的敏感性，例如：在那些TBC1D4 含量相對較少的情況下，TBC1D1 所主導(dǎo)的骨骼肌細(xì)胞中的GLUT4 釋放在Ca2+疊加胰島素刺激下更有效。多個突變實驗分析進(jìn)一步表明：這些協(xié)同作用依賴于TBC1D1的磷酸化酪氨酸結(jié)合域1（phosphotyrosine-binding Domains-1，PTB1）和鈣調(diào)蛋白結(jié)合域（calmodulin-binding Domains，CBD）及一些關(guān)鍵的磷酸化位點（TBC1D4- Thr642，TBC1D1-Thr596）[17]。

2 胰島素誘導(dǎo)骨骼肌GLUT4轉(zhuǎn)位的潛在機(jī)制

2.1 Akt信號通路

在胰島素受體與胰島素結(jié)合以及胰島素受體發(fā)生自磷酸化后，胰島素受體底物（insulin receptor substrate，IRS）1和2均迅速發(fā)生磷酸化改變，IRS1/2均引起磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）激活，然而只有IRS1參與GLUT4轉(zhuǎn)位相關(guān)信號通路的調(diào)節(jié)。二酰甘油激酶（diacylglycerol kinase，DGK）在常規(guī)狀態(tài)下與IRS1 結(jié)合，隨后在胰島素作用下出現(xiàn)分離，以實現(xiàn)GLUT4轉(zhuǎn)位[18]。

PI3K 的活化可進(jìn)一步激活磷脂酰肌醇-蛋白激酶B（phosphatidyinositol 3-kinase {PI3K}- protein kinase B，PKB，即Akt）。在細(xì)胞膜上和胞內(nèi)囊泡中，Akt 與PI3K 產(chǎn)生的磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸（PIP3）結(jié)合，分別經(jīng)由磷脂酰肌醇依賴激酶（phosphatidylinositol-dependent kinase，PDK）和mTORC2 在Thr308和Ser473 位點實現(xiàn)磷酸化?；罨腁kt 可進(jìn)一步磷酸化Rab GAPs（常見為TBC1D1/4），使其失活以失去對Rabs 的阻礙作用進(jìn)而促進(jìn)GLUT4 轉(zhuǎn)位[19]。最新研究顯示TBC1D1/4 調(diào)控GLUT4 轉(zhuǎn)位可能主要通過以下兩種潛在機(jī)制[20]：Akt 和14-3-3 蛋白的結(jié)合作用，即依賴Akt的磷酸化可催化14-3-3蛋白與TBC1D1/4的結(jié)合，結(jié)合后的磷酸化缺陷突變體將不再能阻止GLUT4 轉(zhuǎn)位；另一種途徑可能是通過脂質(zhì)結(jié)合，即TBC1D1/4 上的N 端磷酸酪氨酸結(jié)合（PTB）結(jié)構(gòu)域能調(diào)控GLUT4與細(xì)胞膜的結(jié)合作用，因而可能在此位置進(jìn)行調(diào)控。此外，其他研究還提示：TBC1D13 也可能是一個GLUT轉(zhuǎn)位的調(diào)節(jié)因子，其下游中介因子為Rab35[21]。

2.2 RAC1與GLUT4轉(zhuǎn)位

作為細(xì)胞皮層肌動蛋白的主要調(diào)控因子，RAC1也常常會在胰島素作用下被激活。研究證實肌肉中存在的一種RAC1 的鳥嘌呤核苷酸交換因子（guanine nucleotide exchange factor，GEF）－FLJ00068，在胰島素誘導(dǎo)GLUT4轉(zhuǎn)位過程中發(fā)揮作用[22]。先前的研究還發(fā)現(xiàn)：P-Rex1，一種RAC1 GEF，能促使胰島素介導(dǎo)的GLUT4轉(zhuǎn)位顯著提高[23]，再次證實了RAC1在GLUT4轉(zhuǎn)位中的重要作用。與RAC1激活一致，胰島素能誘導(dǎo)細(xì)胞皮質(zhì)肌動蛋白絲產(chǎn)生分支且干擾其重構(gòu)以降低GLUT4 轉(zhuǎn)位和葡萄糖攝取。而在一項抑制RAC1 的實驗中表明：GLUT4 轉(zhuǎn)位需要肌動蛋白絲的主動重構(gòu)而非預(yù)先成形[18]。重塑的肌動蛋白網(wǎng)能夠作為胰島素衍生信號和GLUT4囊泡的支架，還可能是GLUT4的插入點。

RAC1 介導(dǎo)的肌動蛋白絲重構(gòu)效應(yīng)可能是通過激活成核因子WAVE和神經(jīng)元Wiskott-Aldrich 綜合征蛋白（n-WASP）實現(xiàn)的[18]。n-WASP通過與多種效應(yīng)因子之間的相互作用調(diào)控GLUT4的胞吞作用和轉(zhuǎn)位[24]。n-WASP和WAVE可激活肌動蛋白絲的分支復(fù)合物Arp2/3；使這一復(fù)合物內(nèi)容失活能夠減少胰島素所介導(dǎo)的肌動蛋白重塑以及GLUT4轉(zhuǎn)位。肌動蛋白分支還可激活能切斷肌動蛋白的Slingshot 磷酸酶及其下游靶點的絲切蛋白以及激活游離肌動蛋白的重組[25]。同時，胰島素介導(dǎo)的RAC1活化可激活LIM激酶以抑制絲切蛋白，這會導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)一種肌動蛋白分支——肌動蛋白被切斷——再次產(chǎn)生分支的循環(huán)狀態(tài)。此外，胰島素介導(dǎo)的RAC1活化還可激活骨骼肌細(xì)胞絲氨酸/蘇氨酸激酶PAK1[18]；抑制PAK1 可減弱胰島素誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)肌動蛋白重構(gòu)、絲切蛋白激活以及GLUT4轉(zhuǎn)位[26]。

值得一提的是，盡管Akt和RAC1兩種途徑都是經(jīng)由PI3K激活的胰島素信號通路，且都能部分降低胰島素介導(dǎo)的骨骼肌葡萄糖轉(zhuǎn)運，但是有研究顯示：抑制RAC1 不會影響Akt；與此相似，抑制Akt 也不會影響RAC1，即PI3K 是通過完全不同的途徑激活下游的RAC1 和Akt[27]。雖然有較多證據(jù)證實Akt 和RAC1 是通過獨立的機(jī)制激活胰島素介導(dǎo)的GLUT4 轉(zhuǎn)位，但這兩種通路之間的交互作用仍可能發(fā)生。一項研究發(fā)現(xiàn)Akt的抑制會降低RAC1的活性[28]，連續(xù)性Akt的過表達(dá)能夠?qū)е翿AC1 的激活[28]，而RAC1 的過度激活也能使Akt活化[29]。因此，未來的研究也應(yīng)該更多關(guān)注這兩種途徑之間的潛在交互作用，這可能會為代謝性疾病的治療提供全新方向。

3 AICAR刺激骨骼肌GLUT4轉(zhuǎn)位的潛在機(jī)制

AICAR是一種非臨床使用的實驗室常用AMPK激動劑之一。研究發(fā)現(xiàn)AICAR刺激能有效增強(qiáng)骨骼肌胰島素敏感性[30，31]，這種作用通常是依賴于AMPK途徑實現(xiàn)的，即有效提高骨骼肌細(xì)胞AMPK活性[32]。主要是通過代謝將AMP 轉(zhuǎn)化為結(jié)構(gòu)相似的ZMP，即在不改變AMP/ATP 比值的前提下直接變構(gòu)激活A(yù)MPK；或者是通過激活A(yù)MPK 激酶（AMPKK）活化AMPK[33]。研究證實：AICAR刺激，類似于運動刺激，可能是通過AMPKα 2/β2/γ3 三聚體起作用[10，31]，能夠顯著提高AMPK 及其下游靶點ACC 的磷酸化水平。值得注意的是：AICAR所介導(dǎo)的骨骼肌糖攝取能力的增加與Akt 磷酸化無顯著相關(guān)性[31]，這與先前在小鼠骨骼肌實驗發(fā)現(xiàn)的結(jié)果相一致，即：AICAR 刺激不能促使Akt 磷酸化或磷酸肌醇激酶3 活性增加[30]。提示AMPK 介導(dǎo)的骨骼肌胰島素敏感性增加可能與Akt 下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)即TBC1D1/4的作用有關(guān)。

TBC1D1/4 作為結(jié)構(gòu)相似的同源物，會同時受到AMPK 和Akt 的調(diào)控以及影響骨骼肌葡萄糖轉(zhuǎn)運水平[31]。在AICAR刺激下，先前的研究[10，31]發(fā)現(xiàn)AMPK能夠增加TBC1D1-Ser231、TBC1D4-Thr649 和Ser711 位點的磷酸化水平，進(jìn)而促進(jìn)GLUT4 轉(zhuǎn)位至胞膜而非影響其表達(dá)水平。不同的是，TBC1D1-Ser231 磷酸化位點突變僅對AICAR刺激介導(dǎo)的骨骼肌葡萄糖攝取產(chǎn)生影響，并不影響運動刺激介導(dǎo)的骨骼肌葡萄糖攝取[10]；而TBC1D4-Thr649和Ser711位點的磷酸化主要與AICAR刺激增強(qiáng)的胰島素介導(dǎo)葡萄糖攝取相關(guān)[31]。此外，除TBC1D1/4之外，還可能存在其他因素參與骨骼肌細(xì)胞葡萄糖攝取的調(diào)節(jié)。例如：鳥嘌呤核苷酸交換因子（guanine nucleotide exchange factors，GEFs）可拮抗Rab-GAPs 對其下游Rabs 活化的影響，進(jìn)而調(diào)控GLUT4 轉(zhuǎn)運和葡萄糖攝取。研究顯示：含有4C 的DENN/MADD 結(jié)構(gòu)域（Dennd4C），即一類GEF，在脂肪細(xì)胞中已被證實是一類調(diào)節(jié)GLUT4轉(zhuǎn)位的重要影響因子[34]。因而，這種GEFs 很有可能也存在于骨骼肌并調(diào)控AICAR 刺激或肌肉收縮引起的GLUT4 轉(zhuǎn)位。今后應(yīng)集中研究此類潛在的AMPK介導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞葡萄糖攝取調(diào)節(jié)因子。

4 小結(jié)

GLUT4 介導(dǎo)細(xì)胞在不同條件下的葡萄糖轉(zhuǎn)運，進(jìn)而影響骨骼肌細(xì)胞葡萄糖攝取能力，進(jìn)一步闡明調(diào)控骨骼肌細(xì)胞中GLUT4轉(zhuǎn)位的潛在機(jī)制將為今后運動防治代謝性疾病的研究提供新思路。