章宇丹，李麗，劉軍，李雨芹，劉慶

(四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 自貢,643000)

沙棘是一種獨特的藥食同源植物，具有廣泛的藥理功效。沙棘果實富含維生素A,C,B1,B2,E等、微量元素K、Na、Mn、Fe等，氨基酸和有機酸蘋果酸、琥珀酸，檸檬酸等以及沙棘黃酮類化合物和其他生物活性成分[1-6]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實，沙棘具有抗疲勞、抗腫瘤、降血脂、抗氧化、抗腫瘤、預(yù)防心腦血管疾病和抑制血小板聚集等作用，并且對胃潰瘍、腸損傷也有良好的治療作用[7-12]，是一種不可多得的保鍵食品和藥品原料。

汽酒，也被稱為起泡酒或是發(fā)泡酒，是一種既富含氣體(CO2)又有一定酒精度的飲料[13]。由于汽酒中含有較多CO2氣體，因此在炎炎夏日飲用能帶出人們體內(nèi)的熱量，讓人感受到清涼舒爽[14]。汽酒中的酒精度一般含量較低，大約在0.5%～5%，帶有果汁原有的香甜，適合各年齡層的消費者購買飲用[15]。本試驗以沙棘果汁和蔗糖為主要原料，添加大米糖化液增加口感，利用微生物發(fā)酵產(chǎn)生CO2制備沙棘汽酒，該產(chǎn)品不含防腐劑和其他食品添加劑，綠色安全健康，符合現(xiàn)代人的消費觀念。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙棘果，四川省阿壩州小金縣；大米、蔗糖，超市；酵母，安琪酵母有限公司；糖化酶，泉州市中信實業(yè)有限公司；α-淀粉酶，鄭州萬瑞達(dá)化工產(chǎn)品有限公司；葡萄糖、NaOH、Na2SO3、硅藻土，成都科龍化工試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RJ-TDL-50A冷凍離心機，無錫市瑞江分析儀器有限公司；T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；7890A安捷倫氣相色譜-質(zhì)譜儀，安捷倫科技公司；HWS-260A恒溫恒濕培養(yǎng)箱，杭州綠博儀器有限公司；DSX-18L手提式高壓蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 大米糖化溶液的制備

1.3.1.1 粉碎

將東北大米粉碎過40目篩。

1.3.1.2 糊化

取粉碎后的大米50 g，按料水比1∶4(g∶mL)加入蒸餾水200 mL，混勻后用鹽酸將醪液的pH調(diào)節(jié)至5.5～6.0，加熱，不斷攪拌，直至醪液變成黏稠糊狀。

1.3.1.3 液化

加熱過程中，添加耐高溫的α-淀粉酶(10 U/g)，沸騰30 min后于90 ℃繼續(xù)保溫30 min，保溫過程中可適當(dāng)補充溫水。

1.3.1.4 糖化

用鹽酸將上述醪液pH調(diào)節(jié)至4.0～4.5，冷卻到手溫后按150 U/g大米粉的比例加入活化好的糖化酶酶液，加熱至80 ℃，20 min滅酶處理，冷卻過濾，冷藏保存。

1.3.2 沙棘汽酒的工藝流程

(1)沙棘原汁處理工藝[19]

沙棘果實→破碎壓榨→沙棘果汁→離心去脂(6 000 r/min，5 min)→加入果膠酶→二次離心去雜質(zhì)(6 000 r/min，5 min)→降酸(CaCO3)→澄清過濾→沙棘汁

(2) 沙棘汽酒發(fā)酵工藝

沙棘澄清汁→料水比1∶2(g∶mL)→加大米糖化溶液→調(diào)糖→接種發(fā)酵→轉(zhuǎn)桶→硅藻土過濾→調(diào)配(風(fēng)味、酒精度、糖度)→灌裝→巴氏滅菌→成品

1.4 沙棘汽酒單因素的試驗

1.4.1 發(fā)酵時間的確定

沙棘果汁稀釋后，初始糖度調(diào)至16.0%，酵母接種量30 g/L，大米糖化溶液20 mL/L，發(fā)酵溫度22 ℃，發(fā)酵時間分別為68、72、76、80、84 h，發(fā)酵結(jié)束后以感官評價標(biāo)準(zhǔn)評分，選取口感最佳者，確定最適發(fā)酵時間，以此確定正交梯度水平。

1.4.2 酵母添加量的確定

沙棘果汁稀釋后，初始糖度調(diào)至16.0%，酵母接種量為10、20、30、40、50 g/L，大米糖化溶液20 mL/L，發(fā)酵溫度22 ℃，發(fā)酵76 h，發(fā)酵結(jié)束后以感官評價標(biāo)準(zhǔn)評分，選取口感最佳者，確定最適發(fā)酵時間，以此確定正交梯度水平。

1.4.3 大米糖化溶液添加量的確定

沙棘果汁稀釋后，初始糖度調(diào)至16.0%，酵母接種量30 g/L，大米糖化溶液添加量為20、40、60、80、100 mL/L，發(fā)酵溫度22 ℃，發(fā)酵76 h，發(fā)酵結(jié)束后以感官評價標(biāo)準(zhǔn)評分，選取口感最佳者，確定最適發(fā)酵時間，以此確定正交梯度水平。

1.4.4 發(fā)酵糖度的確定

沙棘果汁稀釋后，初始糖度分別調(diào)至14.0%、16.0%、18.0%、20.0%、22.0%，酵母接種量30 g/L，大米糖化溶液80 mL/L，發(fā)酵溫度22 ℃，發(fā)酵76 h，發(fā)酵結(jié)束后以感官評價標(biāo)準(zhǔn)評分，選取口感最佳者，確定最適發(fā)酵時間，以此確定正交梯度水平。

1.4.5 發(fā)酵溫度的確定

沙棘果汁稀釋后，初始糖度調(diào)至18.0%，酵母接種量30 g/L，大米糖化溶液80 mL/L，發(fā)酵溫度為22、24、26、28、30 ℃，發(fā)酵76 h，發(fā)酵結(jié)束后以感官評價標(biāo)準(zhǔn)評分，選取口感最佳者，確定最適發(fā)酵時間，以此確定正交梯度水平。

1.4.6 正交試驗優(yōu)化沙棘汽酒的發(fā)酵條件

根據(jù)上述單因素試驗，設(shè)定發(fā)酵時間(A)、酵母添加量(B)、大米糖化溶液添加量(C)、發(fā)酵糖度(D)、發(fā)酵溫度(E)五因素四水平的正交試驗，確定最佳工藝條件，因素水平見表1。

表1 正交因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal table

1.5 沙棘汽酒評價指標(biāo)及測定方法

1.5.1 沙棘汽酒的感官評分標(biāo)準(zhǔn)

沙棘汽酒的感官評價標(biāo)準(zhǔn)包括酒體色澤、果香酒香的協(xié)調(diào)性、泡沫刺激感、糖酸比等指標(biāo)。根據(jù)該產(chǎn)品的各項感官指標(biāo)進行百分制評分。

表2 沙棘汽酒的感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluations standards of sea-buckthornsparkling wine

1.5.2 分析方法

酒精度測定：參見文獻(xiàn)[16]；pH測定：采用pH計測定；還原糖測定：參見文獻(xiàn)[17]；總糖測定：參見文獻(xiàn)[17]；總酸測定：參見文獻(xiàn)[18]；揮發(fā)性物質(zhì)檢測[19]：采用頂空固相微萃取法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀；透光率測定：看見文獻(xiàn)[19]。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel、Origin 8.5等軟件對單因素結(jié)果進行分析、作圖，單因素平行試驗進行3組，正交試驗采用平均值及標(biāo)準(zhǔn)差表示[20]。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵工藝單因素試驗結(jié)果與分析

2.1.1 最佳發(fā)酵時間的確定

由圖1可知，隨著發(fā)酵時間的增加，酒體中酒精度升高，酵母生長迅速，將原料中的糖轉(zhuǎn)化為酒精，發(fā)酵時間與酒精度呈正比，與總糖含量呈反比?？偹犭S時間的增加而呈上升趨勢，且發(fā)酵80 h后總酸上升速度較發(fā)酵前期迅速，綜合各理化指標(biāo)以及口感，發(fā)酵時間為76 h時，汽酒中酒精度、總糖、總酸相對適合，故選擇最佳發(fā)酵時間為76 h。

圖1 發(fā)酵時間對汽酒品質(zhì)的影響Fig.1 Effect of time on the fermentation quality of lightsparkling wine注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

2.1.2 酵母接種量對汽酒品質(zhì)的影響

酵母發(fā)酵是釀造沙棘汽酒的重要環(huán)節(jié)，酵母不僅能夠產(chǎn)生乙醇，還能產(chǎn)生其他醇、醛、酯、酸等風(fēng)味物質(zhì)，直接影響沙棘汽酒中感官品質(zhì)，酵母接種量不同，得到的汽酒中酒精度也就不同，口感自然也就不同。

圖2 酵母接種量對汽酒品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of yeast inoculums on the quality of lightsparkling wine

由圖2可知，酵母的接種量越高，酒精度也就越高，與之相對的總糖含量呈下降趨勢，而在接種量為30 g/L時，總糖消耗的速度較快，總酸的含量也上升較快。接種量較少時，酒精度也較低，此時總糖消耗較慢，這是因為酵母接種量過低導(dǎo)致生物活性不足，無法快速將可發(fā)酵性糖轉(zhuǎn)化為酒精，酒體口感平淡。綜合各理化指標(biāo)以及口感，酵母接種量為30 g/L，汽酒中酒精度、總糖、總酸相對合適，故選擇最佳酵母接種量為30 g/L。

2.1.3 大米糖化溶液添加量對汽酒品質(zhì)的影響

大米中淀粉含量高，蛋白質(zhì)、多酚、脂肪含量低，能夠改善沙棘汽酒的口感，降低沙棘汽酒的色度。

由圖3可知，大米糖化溶液的添加對酒體中總酸含量的影響不大，但當(dāng)添加量超過60 mL/L時，酒精度明顯升高，這是由于大米糖化溶液中也含有可供酵母發(fā)酵的糖分，使酵母可利用的糖增加，酒精度也隨之增加。在大米糖化溶液添加量為80 mL/L時，酒體苦澀度降低，綜合各理化指標(biāo)以及口感，大米糖化溶液添加量為80 mL/L時，汽酒中酒精度、總糖、總酸相對合適。

圖3 大米糖化溶液對汽酒品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of rice saccharified liquid on the quality oflight sparkling wine

2.1.4 初始糖度對汽酒品質(zhì)的影響

沙棘原汁中有機酸含量較高，而含糖量僅3%，若直接使用原汁發(fā)酵，無論是口感還是酒精度都達(dá)不到標(biāo)準(zhǔn)。因此，果汁發(fā)酵前需加入白砂糖，調(diào)節(jié)發(fā)酵液至合適的糖度再進行酒精發(fā)酵。初始糖度的高低會直接影響沙棘汽酒的口感。

由圖4可知，隨著糖度的增加，酒精度變化不大，可能原因是發(fā)酵時間較短，酵母能夠利用的糖度有限，轉(zhuǎn)化成的酒精量也有限；總糖呈現(xiàn)先下降后期有略微上升的趨勢，推測原因是沙棘本身酸度對發(fā)酵中的酒體總糖有影響，總酸先略微上升，后期下降，原因是糖度較低，沙棘本身偏酸，影響了酵母生長。綜合各理化指標(biāo)以及口感，初始糖度為18%時，汽酒中酒精度、總糖、總酸相對合適。

2.1.5 發(fā)酵溫度對汽酒品質(zhì)的影響

圖4 初始糖度對汽酒品質(zhì)的影響Fig.4 Effect of initial sugar content on the quality oflight sparkling wine

由圖5可知，發(fā)酵溫度對酒體中總酸含量的影響不大，酒精度隨溫度升高而升高，但當(dāng)發(fā)酵溫度高于24 ℃時，酒精度升高速率減緩，這是由于溫度升高，使酵母代謝速率加快，得酵母過早衰亡，而酵母細(xì)胞死亡自溶后與其他物質(zhì)作用分解會增加酒體內(nèi)不良風(fēng)味，因此感官評價也隨之降低?？偹岷肯认陆翟俾晕⑸仙?，總糖先下降后上升之后又下降，綜合各理化指標(biāo)以及口感，發(fā)酵溫度為24 ℃，汽酒中酒精度、總糖、總酸相對合適。

圖5 發(fā)酵溫度對汽酒品質(zhì)的影響Fig.5 Effect of temperature on the quality of light sparklingwine

2.2 發(fā)酵工藝各參數(shù)的正交試驗與分析

由表3可知，以感官評價為指標(biāo)，按照極差的大小列出各因素對沙棘汽酒品質(zhì)影響的主次進行排序，其順序為：A>D>C>E>B，發(fā)酵時間是最主要的影響因素，其次是初始糖度，接著是大米糖化溶液添加量，然后是發(fā)酵溫度，影響最低的是酵母接種量。通過K值確定最佳工藝參數(shù)是A4B1C4D2E3，即發(fā)酵時間80 h，酵母接種量20 g/L，大米糖化溶液添加量100 mL/L，初始糖度18%，發(fā)酵溫度25 ℃。

表3 正交試驗結(jié)果Table 3 The results of orthogonal test

續(xù)表3

試驗號A/hB/(g·L-1)C/(mL·L-1)D/%E/℃感官評價103243184113312476123421375134142392144231485154324188164413282K1325326312308314K2310326320313313K3315328325336337K4347317342340333k181.2581.5787778.5k277.581.58078.2578.25k378.758281.258484.25k486.7579.2585.58583.25極差R9.252.757.586

注：ki為Ki的平均值。

2.3 驗證試驗

根據(jù)以上數(shù)據(jù)進行驗證性試驗，通過感官評價分析發(fā)現(xiàn)，按照上述條件發(fā)酵的果酒酒體呈鮮亮的金黃色，沙棘果香濃郁，酒香與果香相輔相成，泡沫細(xì)膩濃郁，酸甜可口，回味悠長，酒精度在(5±0.5)%vol。因此理論最佳工藝為最優(yōu)工藝。

2.4 沙棘汽酒中香氣成分分析

利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，使用頂空固相微萃取法檢測沙棘果汁和沙棘汽酒中的揮發(fā)性物質(zhì)，結(jié)果見圖6和圖7。

圖6 沙棘果汁中香氣成分GC-MS圖Fig.6 The GC-MS of favor components of sea-buckthornjuice

圖7 沙棘汽酒中香氣成分GC-MS圖Fig.7 The GC-MS of favor components of sea-buckthornlight sparkling wine

由表4可知，通過頂空固相微萃取，沙棘果汁和沙棘汽酒中共檢測出12種醇類物質(zhì)，其中3種為兩者共有，但含量差距較大，兩者主要醇類物質(zhì)為乙醇，未發(fā)酵的果汁中檢測出酒精，其原因為沙棘果實表皮存在野生酵母，而由于儲存時間長造成少量果汁發(fā)酵，產(chǎn)生了酒精。

酯類化合物能夠使沙棘汽酒帶有濃郁果香，沙棘果汁與沙棘汽酒中共檢測出了10種酯類物質(zhì)，其中僅2種為兩者共有。沙棘果汁和沙棘汽酒中香氣的主要成分分別為乙酸乙酯和辛酸乙酯。

表4 沙棘果汁與沙棘汽酒中香氣成分組成對比Table 4 The differences between sea-buckthorn juice andlight sparkling wine

續(xù)表4

編號化合物名稱沙棘果汁/%沙棘汽酒/%26三氯甲烷0.284-271-己醇0.798-28芳樟醇氧化物反式1.409-291-庚醇1.611-306-甲基-5-庚烯-2-醇0.307-31氧化鈣0.436-322-乙基己醇0.281-331-辛醇0.462-34環(huán)辛烷0.885-35松油醇0.252-36溴苯乙酸甲酯0.587-37苯基乙醇3.212-38正丁基硼酸0.451-

注：“-”表示檢出。

3 結(jié)論

本試驗通過對沙棘汽酒主發(fā)酵工藝的研究，利用單因素、正交試驗和驗證試驗確定了沙棘汽酒最優(yōu)發(fā)酵工藝條件：發(fā)酵時間為80 h，酵母接種量為20 g/L，大米糖化溶液添加量為100 mL/L，初始糖度為18%，發(fā)酵溫度為25 ℃。在這種條件下，得到的沙棘汽酒酸甜可口，果酒酒體呈鮮亮的金黃色，沙棘果香濃郁，酒香與果香相輔相成，泡沫細(xì)膩濃郁，回味悠長，酒精度在(5±0.5)%vol，口感豐富。

由于沙棘果實中有機酸含量較高，現(xiàn)階段研究主要集中利用在醫(yī)療、食品、保健品等方面，對沙棘酒精飲料的研究還存在不足，因此造成大量沙棘果汁的浪費。本研究將沙棘汽酒的釀造與農(nóng)民當(dāng)前利益相結(jié)合，為沙棘作物的綜合研究提供了另一種可能。