秦鵬，路等學，康紅梅，韓融冰，郭瑞，趙玉卉，魏甲乾，王治業(yè), 2*

1(甘肅省科學院 生物研究所，甘肅 蘭州，730000)2(甘肅省科學院 生物研究所，甘肅省微生物資源開發(fā)利用重點實驗室，甘肅 蘭州，730000)

真菌的分離純化是真菌生物學研究和資源開發(fā)利用的基礎和前提[1]，真菌培養(yǎng)基存在大量的異質細胞樣本，對該樣本進行生化分析，其結果僅反映了平均水平，可能會掩蓋關鍵因素，影響真菌生物學機理的解析，所以，可靠、穩(wěn)定和便捷的單孢分離方法對真菌資源的開發(fā)利用、生物學特性的研究以及群體細胞中的罕見基因資源的挖掘有著重要的意義。常用的真菌單孢分離純化法有：平板涂布法、瓊脂糖半固體培養(yǎng)基法、微孔過濾法、密度梯度法和顯微操作法等。平板涂布法是應用最廣泛的方法，GARCIA等[2]應用平板涂布法分離和明確了200個調味料樣品中的污染真菌；NOMAN等[3]應用平板涂布法分離了醫(yī)療廢棄物的真菌并分析了污染源；LIM等[4]應用平板涂布法從野生蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)子實體分離出桑白盾蚧病原真菌(Simplicilliumlanosoniveum)。此外，YUAN等[5]聯合應用瓊脂糖半固體和顯微操作法分離野生黑木耳(Auriculariaheimuer)的單孢并進行了全基因組測序；KOYAMA等[6]聯合應用微孔過濾和密度梯度法從野外土壤中分離叢植菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal fungi)的單孢；SELVAKUMAR等[1]應用顯微操作法分離和純化了叢植菌根真菌；劉一凡等[7]應用顯微操作法成功地分離和純化了十字花科作物病害真菌蕓薹根腫菌(Plasmodiophorabrassicae)。

分離真菌單孢的方法具有不同的優(yōu)缺點：平板涂布法操作簡便易行、適用性廣，但真菌單孢僅能在培養(yǎng)基表面形成單菌落，單孢分離的通量較低，涂布操作不僅損失較多孢子而且使部分孢子聚集；瓊脂糖半固體培養(yǎng)基方法操作簡便，真菌單孢在培養(yǎng)基表面和內部均能形成單菌落，單孢分離通量較高，但瓊脂糖培養(yǎng)基流動性差、熔點高(44 ℃)，不利于孢子的混勻和生長；有限稀釋法易于顯微觀察孢子和單菌落的形態(tài)特征，單孢分出率較高，但操作繁瑣耗時，效率極低，易污染；顯微操作法便于顯微觀察真菌孢子，獲得單孢的可靠性較高，但操作繁瑣耗時，易污染；微孔過濾法分離效率較高，但單孢分出率低，易污染，常與其他單孢分離法聯合使用[6]。

近年來，腫瘤細胞異質性的研究促進了單細胞分離技術的迅猛發(fā)展，為真菌單孢分離技術的開發(fā)提供了新思路，如微孔過濾[8]、有限稀釋、雙向電泳[9]、磁泳[10]、電鏡拍照[11]。這些技術已用于分離單個癌細胞，然而依然存在局限性。如，雙向電泳分離通量低，微孔過濾和有限稀釋操作繁瑣，低通量和高成本的電鏡拍照技術限制了其廣泛應用，免疫磁珠的分離效率亦較低，熒光標記和激光捕獲方法損傷細胞功能，不利于下游分析[12]。依賴于細胞分選設備和顯微鏡的微流體技術也被用于分離單個癌細胞[13]，但該技術高昂的儀器成本和條件需求限制了其廣泛應用。甲基纖維素半固體培養(yǎng)基已被廣泛應用到雜交瘤單細胞系的篩選[14]，該方法具有簡單、便捷、穩(wěn)定、高通量和成本低的特點。但是，國內外尚未見利用甲基纖維素半固體培養(yǎng)基分離真菌單孢的研究尚未見國內外報道。

甲基纖維素半固體培養(yǎng)基具有良好的流動性和固定作用，而真菌孢子不具備運動功能，混勻后的真菌孢子在甲基纖維素培養(yǎng)基內的相對位置固定。靜置培養(yǎng)后，孢子萌發(fā)形成彼此隔離、分布均勻的單菌落，可利用移液槍將單菌落轉移至下游培養(yǎng)基。因此，甲基纖維素半固體培養(yǎng)基法可能具備以下優(yōu)點：移液槍操作，簡便、高效、穩(wěn)定、孢子損失少；真菌單孢在甲基纖維素半固體培養(yǎng)基內部和表面均能萌發(fā)形成單菌落，顯著提高了真菌單孢分離的通量；在0～50 ℃時，甲基纖維素半固體培養(yǎng)基為透明黏稠液體，可通過調節(jié)其有色組分的質量濃度以適應不同真菌單孢的分離；甲基纖維素半固體培養(yǎng)基能溶解少量氧氣，具備常溫下分離專性需氧和兼性厭氧真菌單孢的潛力。甲基纖維素半固體培養(yǎng)基法的諸多優(yōu)點使其不僅在專性需氧、兼性厭氧型真菌單孢分離中有良好的應用前景，而且具有分離專性厭氧和呼吸缺陷型真菌的潛力。而在分離大量的誘變真菌單孢時，甲基纖維素半固體培養(yǎng)基法聯合96深孔板高通量篩選目標誘變菌的策略將極大地提高誘變真菌選育的效率。

本研究以蛹蟲草菌為例，開發(fā)了一種基于甲基纖維素半固體培養(yǎng)基的真菌單孢的分離方法，并將該方法與平板涂布、瓊脂糖半固體培養(yǎng)基、有限稀釋和顯微操作法進行了比較，為真菌單孢分離提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與培養(yǎng)基

菌種：蛹蟲草菌C.militarisCICC 14014(CM-1)，中國工業(yè)微生物菌種保藏中心；蛹蟲草菌C.militarisCGMCC 3.4655(CM-3)，中國普通微生物菌種保藏中心。

基礎培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖16、蛋白胨8、KH2PO41、MgSO4·7H2O 1。

平板培養(yǎng)基：基礎培養(yǎng)基添加瓊脂18 g/L。

甲基纖維素半固體培養(yǎng)基：基礎培養(yǎng)基添加適量甲基纖維素。

瓊脂糖半固體培養(yǎng)基：基礎培養(yǎng)基添加適量瓊脂糖。

PBS(g/L)：NaCl 8.000、KCl 0.201、Na2HPO4·12H2O 3.581、KH2PO40.240，pH值約7.2。

1.1.2 試劑與耗材

試劑：葡萄糖、蛋白胨、MgSO4·7H2O、KH2PO4、NaCl、KCl、Na2HPO4·12H2O、瓊脂、瓊脂糖，中國醫(yī)藥集團有限公司；質量濃度1 g/L亞甲基藍溶液，北京索萊寶科技有限公司；中黏度甲基纖維素(黏度：4 000 MPa·s)，生工生物工程上海股份有限公司；水為市售純凈水。

耗材：聚丙烯96深孔板(每孔體積2 mL)、96深孔板聚丙烯軟蓋、聚苯乙烯96微孔板和50 mL聚丙烯離心管，百思泰實驗器材有限公司(江蘇省南通市)。

1.1.3 設備與儀器

移液槍，北京大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司；生物顯微鏡(XSP-2CA)，上海光學儀器公司；生化培養(yǎng)箱(SPJ-150)，上海君竺儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 孢子懸液的制備

各取一支保存CM-1和CM-3蛹蟲草菌的試管，分別制備CM-1和CM-3孢子懸液。用5 mL無菌PBS洗脫孢子，用無菌脫脂棉過濾孢子溶液，采用1 g/L亞甲基藍溶液染色[15]和血球計數板計數法[16],統(tǒng)計并稀釋活孢子濃度至1×103個/mL備用。

1.2.2 五種真菌單孢分離方法的操作步驟

甲基纖維素半固體培養(yǎng)基法：向250 mL錐形瓶裝入70 ℃的200 mL基礎培養(yǎng)基后并添加一定質量濃度的甲基纖維素，于冰浴冷卻至室溫并不斷用玻璃棒攪拌，以20 mL/50 mL三角瓶的裝液量裝載甲基纖維素半固體培養(yǎng)基，塞緊瓶塞，滅菌后備用；向上述甲基纖維素半固體培養(yǎng)基接種150 μL CM-1孢子懸液；塞緊瓶塞后充分搖勻；于25 ℃恒溫避光靜置培養(yǎng)3 d，用1 000 μL無菌移液槍頭吸附可分離單菌落并接入下游培養(yǎng)基。

關鍵技術點：在溶解甲基纖維素時，為防止產生甲基纖維素的沉淀，使得甲基纖維素均勻分散到基礎培養(yǎng)基內，基礎培養(yǎng)基的溫度應高于70 ℃。孢子懸液(使用PBS制備)的接種量應低于200 μL/20 mL以防止發(fā)生鹽析；搖勻培養(yǎng)基中的孢子時，培養(yǎng)基液面不宜超出三角瓶高度的1/3，以防止孢子滯留形成貼壁單菌落，影響觀察。

有限稀釋法：參考李小芬等[17]的方法并改進。將96微孔板置于超凈工作臺紫外燈照射3 h滅菌；移取200 μL CM-1孢子懸液至96微孔板A1孔，其他各孔添加75 μL已滅菌的基礎培養(yǎng)基，以每孔75 μL的移液量，從A1依次連續(xù)稀釋至H1，再按A1～A12，……，H1～H12順序依次連續(xù)稀釋，每組操作前更換已滅菌的槍頭；用已滅菌的封口膜密封96微孔板，于25 ℃恒溫避光靜置培養(yǎng)3 d后，用已滅菌的1 000 μL移液槍頭將可分離單菌落接入下游培養(yǎng)基。96微孔板的滅菌為關鍵步驟。

平板涂布法步驟：參考段斌等[16]的方法并修改。無菌條件下，將涂布器在酒精燈外焰滅菌，待涂布器溫度降至室溫后，移取150 μL的上述CM-1孢子懸液至已滅菌的PDA平板中央，均勻涂布后，于25 ℃恒溫避光靜置培養(yǎng)3 d后，用已滅菌的接種針將可分離單菌落接入下游培養(yǎng)基。其中，涂布器滅菌及其溫度降至室溫后再接種為關鍵步驟。

瓊脂糖半固體培養(yǎng)基法：參考任瑞敏等[14]的方法并改進。每50 mL三角瓶裝載20 mL瓊脂糖半固體培養(yǎng)基，滅菌，待培養(yǎng)基溫度降至室溫后，無菌條件下，向已滅菌的瓊脂糖半固體培養(yǎng)基接種150 μL上述CM-1孢子懸液，塞緊瓶塞后充分搖勻，于25 ℃恒溫避光靜置培養(yǎng)3 d，用已滅菌的接種針將可分離單菌落接入下游培養(yǎng)基。其中，瓊脂糖半固體培養(yǎng)基的溫度降至室溫后再接種為關鍵步驟。

顯微操作法：參考魏峰等[18]的方法并改進。取上述CM-1孢子懸液，用滅菌水稀釋成一系列濃度梯度，各取10 μL滴在各載玻片上，靜置5 min，用記號筆標記液滴范圍，利用生物顯微鏡計算每10 μL各濃度梯度的孢子懸液的孢子個數；無菌條件下，利用篩選的每10 μL孢子懸液含1個孢子的稀釋方法，對150 μL的CM-1孢子懸液進行稀釋，再以每孔10 μL的接種量，向滅菌的每孔含1 mL PDA培養(yǎng)基的96深孔板接種稀釋的孢子懸液，接種完所有的稀釋孢子懸液后，用滅菌的軟蓋密封96深孔板并于25 ℃恒溫避光靜置培養(yǎng)3 d，用接種針將可分離單菌落接入下游培養(yǎng)基。其中，利用生物顯微鏡計算孢子數量的操作為關鍵步驟。

1.2.3 甲基纖維素及瓊脂糖半固體培養(yǎng)基的優(yōu)化

采用單因素實驗分別研究不同質量濃度的甲基纖維素(7、11、15、19、23、27 g/L)和瓊脂糖(5、10、20、30、40、50、60、70 g/L)對半固體培養(yǎng)基中可分離單菌落數量的影響。實驗步驟同上述1.2.2的甲基纖維素和瓊脂糖半固體培養(yǎng)基法，再以半固體培養(yǎng)基內可分離單菌落的數量為指標，確定最優(yōu)濃度。

1.2.4 五種真菌單孢分離方法的比較

利用上述1.2.3篩選的甲基纖維素和瓊脂糖半固體培養(yǎng)基，以及有限稀釋、平板涂布和顯微操作法(實驗步驟同上述1.2.2)，分別對150 μL的上述CM-1孢子懸液進行單孢分離，以可分離單菌落數量、操作步驟、培養(yǎng)基特性、操作特性和分離效率為指標比較5種方法。

1.2.5 優(yōu)化的甲基纖維素半固體培養(yǎng)基分離不同真菌單孢的可行性

利用上述1.2.3篩選的甲基纖維素半固體培養(yǎng)基分別對150 μL和30 μL的上述CM-1以及150 μL的上述CM-3孢子懸液進行單孢分離，明確上述篩選的甲基纖維素半固體培養(yǎng)基分離不同的蛹蟲草菌孢子的可行性。

1.4 數據處理

結果采用均值±標準差表示；統(tǒng)計軟件采用SPSS 22.0，多重檢驗采用Duncan法；折線和柱形圖采用Origin 2018；彩色照片矢量圖的處理，采用軟件Adobe Illustrator CS6。

2 結果與分析

2.1 半固體培養(yǎng)基的優(yōu)化

可分離單菌落是彼此隔離、無交互作用和易于分離的單菌落。2種半固體培養(yǎng)基法獲得的單菌落分為3類：可分離單菌落、聚集的單菌落、培養(yǎng)基液面以上的貼壁單菌落。其中，聚集的單菌落之間存在交互作用，對單菌落的遺傳背景和分離產生了不利的影響，此外，貼壁單菌的分離難度大。因此，以可分離單菌落數量為指標優(yōu)化半固體培養(yǎng)基。

實驗設置甲基纖維素的質量濃度范圍為7～27 g/L，在設置的質量濃度范圍內，隨甲基纖維素質量濃度的增加，可分離單菌落數量先增加后下降(圖1和圖2-a)。不同質量濃度的甲基纖維素對可分離單菌落數量的影響見圖2-a，當甲基纖維素質量濃度小于11 g/L時，單菌落均位于培養(yǎng)基底部，可分離單菌落數量為零；當甲基纖維素質量濃度在15～19 g/L時，可分離單菌落數量開始緩慢增加，較小的單菌落均勻分散在培養(yǎng)基內，可分離單菌落數量為17個，而較大的單菌落散落至培養(yǎng)基底部，培養(yǎng)基表面無單菌落形成；當甲基纖維素質量濃度為23 g/L時，全部的單菌落均勻分散至培養(yǎng)基，培養(yǎng)基表面的可分離單菌落數量達6個，可分離單菌落總數達最大，為78個，顯著多于其他質量濃度下的可分離單菌落數量(P<0.01)；而當甲基纖維素質量濃度大于23 g/L，培養(yǎng)基中出現甲基纖維素沉淀，單菌落聚集，可分離單菌落數量快速下降至18個(P<0.01)。究其原因，靜置培養(yǎng)過程中，真菌孢子在培養(yǎng)基中的空間位置受孢子質量和培養(yǎng)基黏度的影響，當培養(yǎng)基黏度增加至足以支撐孢子的質量時，孢子在培養(yǎng)基中的空間位置得以固定，否則便會沉降至培養(yǎng)基底部。當培養(yǎng)基黏度較低(7～11 g/L)時，全部的孢子逐漸沉降至培養(yǎng)基底部形成聚集的單菌落；繼續(xù)增加培養(yǎng)基黏度(11～19 g/L)，因孢子的遺傳背景、大小和質量存在差異，少數質量較小的孢子的空間位置固定從而形成可分離單菌落，而質量較大的孢子逐漸沉降至培養(yǎng)基底部形成聚集的單菌落；當培養(yǎng)基黏度適宜(23 g/L)時，全部孢子的空間位置得以固定形成了可分離單菌落；繼續(xù)增加培養(yǎng)基黏度(大于27 g/L)時，培養(yǎng)基中的甲基纖維素無法充分溶解而形成沉淀，無法充分搖勻孢子，進而形成大量聚集生長的單菌落，可分離單菌落數量急劇下降。

a-7 g/L;b-11 g/L;c-15 g/L;d-19 g/L;e-23 g/L;f-27 g/L圖1 不同質量濃度的甲基纖維素對液體培養(yǎng)基中單菌落分布的影響Fig.1 The effect of different concentration of methylcellulose in liquid medium on thedistribution of single colonies

a-甲基纖維素質量濃度的優(yōu)化;b-瓊脂糖質量濃度的優(yōu)化圖2 半固體培養(yǎng)基的優(yōu)化Fig.2 Optimizing component concentration in the semisolid medium注：所有大寫字母不同表示在P<0.01水平上差異顯著，所有小寫字母不同表示在P<0.05水平上差異顯著。下同。

在設置的質量濃度范圍內，隨瓊脂糖質量濃度的增加，可分離單菌落數量先增加后減少，可分離單菌落均位于培養(yǎng)基表面。在瓊脂糖質量濃度為5～50 g/L范圍內，隨瓊脂糖質量濃度的增加，可分離單菌落緩慢增加至最大，為39個；繼續(xù)增加瓊脂糖質量濃度，可分離單菌落數量快速下降(P<0.05)，而聚集的單菌落數量快速增加(圖2-b)。因此，瓊脂糖的優(yōu)化質量濃度為50 g/L。

2.2 真菌單孢分離方法的比較分析

利用5種方法分別對理論活孢子數量為150個的CM-1孢子懸液進行單孢分離，優(yōu)化的甲基纖維素培養(yǎng)基、平板涂布、顯微操作、有限稀釋和優(yōu)化的瓊脂糖培養(yǎng)基法獲得的可分離單菌落數量依次為96、70、37、35和26個(圖3)。

圖3 五種真菌單孢分離方法分別獲得CM-1可分離單菌落的數量Fig.3 The number of partible single colonies of strainCM-1 separately obtained by five methods used toisolate fungal single-spores

優(yōu)化的甲基纖維素半固體培養(yǎng)基法獲得的可分離單菌落數量顯著高于平板涂布法(P<0.05)，而平板涂布法獲得的可分離單菌落數量顯著高于其他3種方法(P<0.01)，后3種方法獲得的可分離單菌落數量之間無顯著差異(P<0.05)。因此，甲基纖維素半固體培養(yǎng)基法獲得的可分離單菌落數量顯著高于其他4種方法(P<0.05)。

(a)優(yōu)化的甲基纖維素半固體培養(yǎng)基、(b)優(yōu)化的瓊脂糖半固體培養(yǎng)基、(c)顯微操作、(d)平板涂布和(e)有限稀釋法在操作步驟、培養(yǎng)基特性、操作特性和分離效率上存在較大差異(見表1)。

表1 五種真菌單孢分離方法的比較分析Table 1 A comparative analysis of five methods used to isolate fungal single-spores

在操作步驟上，a、b和d方法簡單易行，操作耗時依次為1、1和3 min，而c和e方法操作繁瑣，操作耗時依次為120和90 min。在培養(yǎng)基特性上，a和b方法采用半固體培養(yǎng)基，但a方法的培養(yǎng)基在室溫時呈液態(tài)且不損傷孢子，有利于真菌單孢的分離與培養(yǎng)，分離通量較高，c和d方法采用固體培養(yǎng)基，可分離單菌落僅位于固體培養(yǎng)基表面，分離通量較低，而e方法采用液體培養(yǎng)基，分離真菌單孢的潛力弱于其他4種方法。在獲得的可分離單菌落數量上，a方法明顯優(yōu)于其他4種方法。因此，a方法在操作步驟、培養(yǎng)基特性、操作特性和分離效率上均優(yōu)于其他4種方法。

分別向每50 mL三角瓶的20 mL優(yōu)化的甲基纖維素半固體培養(yǎng)基中接入150 μL的CM-3(圖4的C1)、150 μL的CM-1(圖4的C2)和30 μL的CM-1(圖4的C3)孢子懸液并充分搖勻，25 ℃恒溫避光靜置培養(yǎng)3 d后，形成的單菌落如圖4所示。CM-1和CM-3單菌落都均勻分散至優(yōu)化的甲基纖維素半固體培養(yǎng)基中，每個單菌落由致密的單菌落核心和疏松的周圍菌絲構成，CM-1單菌落直徑明顯大于CM-3，說明優(yōu)化的甲基纖維素半固體培養(yǎng)基適用于不同類型的蛹蟲草菌的單孢分離。

圖4 優(yōu)化的甲基纖維素半固體培養(yǎng)基中的單菌落Fig.4 Single colonies in the optimized semisolidmethylcellulose medium

3 結論

甲基纖維素和瓊脂糖的優(yōu)化質量濃度分別為23和50 g/L；優(yōu)化的甲基纖維素半固體培養(yǎng)基、平板涂布、顯微操作、有限稀釋和優(yōu)化的瓊脂糖半固體培養(yǎng)基法獲得的可分離單菌落數量依次為96、70、37、35和26個，操作耗時依次為1、3、120、90和1 min；優(yōu)化的甲基纖維素半固體培養(yǎng)基法在操作步驟、培養(yǎng)基特性、操作特性和分離效率上均優(yōu)于其他4種方法。

與傳統(tǒng)方法相比，優(yōu)化的甲基纖維素半固體培養(yǎng)基法具備諸多優(yōu)勢和應用潛力：培養(yǎng)基在0～50 ℃時為透明黏稠液體，有利于室溫條件下真菌孢子萌發(fā)形成單菌落；調整培養(yǎng)基中有色組分的質量濃度可改變培養(yǎng)基顏色，更易于觀察不同類型真菌的單菌落；該方法采用的移液槍操作簡單、高效和穩(wěn)定，極大地提高了操作效率；真菌孢子在優(yōu)化的甲基纖維素半固體培養(yǎng)基內部和液面均能形成單菌落，顯著提高了真菌單孢分離的通量；在進行不同誘變條件下誘變孢子的分離以及誘變單菌落的轉移時，優(yōu)化的甲基纖維素半固體培養(yǎng)基法的搖勻孢子和換槍頭操作簡便高效，此外，甲基纖維素半固體培養(yǎng)基的內部和液面均適合誘變孢子形成誘變單菌落，提高了誘變孢子的分離通量，利用移液槍將目標誘變單菌落接入96深孔板的策略進一步提高誘變真菌的選育效率，而對于傳統(tǒng)的平板涂布法[19]，涂布器和接種針的滅菌操作較繁瑣，誘變孢子僅在平板培養(yǎng)基表面生長，分離通量較低；優(yōu)化的甲基纖維素半固體培養(yǎng)基易于構建專性需氧和兼性厭氧環(huán)境，具有分離專性厭氧和呼吸缺陷型真菌的潛力。

盡管如此，優(yōu)化的甲基纖維素半固體培養(yǎng)基法的諸多問題仍需改進，如(1)血球計數板計數法繁瑣耗時；(2)因纖維素降解酶能降解甲基纖維素，本方法可能不適用于纖維素酶產生真菌的孢子分離；(3)當每20 mL優(yōu)化的甲基纖維素半固體培養(yǎng)基中的PBS添加量超過200 μL時，優(yōu)化的甲基纖維素半固體培養(yǎng)基易發(fā)生鹽析，影響單菌落的觀察。對于第一個問題，采用無需熒光標記的神經網絡算法計數活細胞[20]和人工智能實驗系統(tǒng)[21]來提高效率；優(yōu)化培養(yǎng)條件以克服第2個，如降低纖維素酶活性和分泌的同時提高菌絲體生長速度，但此問題有待進一步驗證明確；可使用滅菌的純凈水制備孢子懸液解決第3個問題。綜上，本研究明確了優(yōu)化的甲基纖維素半固體培養(yǎng)基法分離CM-1和CM-3蛹蟲草菌孢子的可行性，利用該方法分離其他真菌孢子的可行性有待進一步驗證。