朱霞建，談安群，范佳瑩，李則靈，周琦，易鑫，李貴節(jié)，郭莉，譚祥，黃林華，王華

(西南大學(xué) 柑桔研究所，重慶,400712)

橙汁加工過程中會(huì)產(chǎn)生大量的果皮渣、果肉渣和種籽等副產(chǎn)物，工業(yè)上一般是將這些副產(chǎn)物作填埋處理或直接丟棄，造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[1-2]。目前，這些加工廢渣主要用于提取精油、檸檬苦素、黃酮等功能性成分，存在成本高、提取率低等問題；也可經(jīng)干燥或發(fā)酵后作為動(dòng)物飼料，但由于味苦、不利于動(dòng)物消化，利用率較低[3-5]。果肉渣中糖含量約為8%～11%，以小分子糖如葡萄糖、蔗糖、果糖的形式存在，并且含有豐富的膳食纖維，精油含量極低[6]。因此，柑橘果肉渣是優(yōu)質(zhì)的發(fā)酵原料。

本研究以榨汁后的甜橙果肉渣為原料，結(jié)合酶工程技術(shù)，通過發(fā)酵制備新型柑橘果酒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甜橙果肉渣,西南大學(xué)柑桔研究所中試車間；果酒酵母RC212、果酒酵母D254、果酒酵母EC1118(A1、A2、A3)，拉曼德公司；果酒酵母SY、果酒酵母RW、高活性干酵母(A4、A5、A6)，安琪酵母公司；沒食子酸、綠原酸、咖啡酸等標(biāo)準(zhǔn)品，北京索萊寶科技有限公司；果膠酶(50 000 U/g)，諾維信有限公司；福林酚試劑，北京索萊寶科技有限公司；NaNO2，Al(NO3)2，Na2CO3等，成都市科龍化工試劑廠,均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1901紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；BT224S電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；Ultimate3000高效液相色譜儀，美國戴安公司;阿貝折光儀，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

操作要點(diǎn)：果肉渣按一定比例加水混勻后打漿，按果漿的總質(zhì)量加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%的果膠酶置于45 ℃酶解90 min；成分調(diào)整：添加焦亞硫酸鉀使SO2質(zhì)量濃度為50 mg/L后，再用檸檬酸調(diào)節(jié)pH至4.0。

酵母活化：稱取一定量的活性干酵母,加入20倍質(zhì)量的5%蔗糖溶液，在35 ℃下活化20 min。發(fā)酵前期通氣攪拌，并觀察發(fā)酵液中無氣泡產(chǎn)生即主發(fā)酵結(jié)束。繼續(xù)發(fā)酵10～15 d后至殘?zhí)橇俊?2 g/L停止發(fā)酵。用100目紗布過濾分離酒渣，酒液轉(zhuǎn)至12～18 ℃下低溫陳釀30 d。采用硅藻土進(jìn)行下膠澄清處理后即為甜橙果肉渣發(fā)酵酒。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

調(diào)整初始糖度為22%、接種量為0.2%、發(fā)酵溫度28 ℃，考察加水比例(1∶0、1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2)對(duì)發(fā)酵酒的影響；選取最佳加水比例，調(diào)整初始糖度為22%、接種量為0.2%、發(fā)酵溫度28 ℃，考察酵母種類(A1、A2、A3、A4、A5、A6)對(duì)發(fā)酵酒的影響；選用最佳菌種及比例，調(diào)整初始糖度22%、發(fā)酵溫度28 ℃，考察接種量(0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%)對(duì)發(fā)酵酒的影響；選用最佳菌種及比例，調(diào)整酵母接種量為0.2%、發(fā)酵溫度28 ℃，考察初始糖度(18%、20%、22%、24%、26%)對(duì)發(fā)酵酒的影響；選用最佳菌種及比例，調(diào)整初始糖度22%、接種量0.2%，考察發(fā)酵溫度(22、24、26、28、30 ℃)對(duì)發(fā)酵酒的影響。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵工藝

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇以菌種接種量、初始糖度和發(fā)酵溫度3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，以感官評(píng)分、黃酮和總酚含量為響應(yīng)指標(biāo)，確定果肉渣發(fā)酵酒的最佳工藝條件，因素與水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface infermentation process

1.3.4 指標(biāo)測(cè)定

1.3.4.1 得酒率的計(jì)算

得酒率計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

1.3.4.2 理化指標(biāo)的測(cè)定

酒精度按GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》采用酒精計(jì)法[7]；殘?zhí)橇坎捎弥苯拥味ǚy(cè)定[16]。黃酮含量參考TIAN等[8]的方法，采用NaNO2-Al(NO3)3方法，稍作改進(jìn)。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：y=719.61x-9.223 5，R2=0.998 7?？偡雍繀⒖糄U等[9]的方法，采用Folin-Ciocaltue法，略作修改。以沒食子酸為對(duì)照品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=61.489x+1.999，R2=0.997 2。

1.3.4.3 感官評(píng)價(jià)

由10位課題組同學(xué)經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)后組成感官評(píng)定小組，參照葡萄酒、果酒通用分析方法中的感官評(píng)定方法，從外觀、香氣、口感、風(fēng)格4個(gè)方面，根據(jù)表2的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分，最終結(jié)果取平均值。

1.3.4.4 酚類物質(zhì)的測(cè)定

樣品的制備：取10 mL發(fā)酵酒用2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH為7左右，加入10 mL乙酸乙酯反復(fù)萃取3次取上清液，殘液用2 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH為2左右，重復(fù)萃取3次后合并上清液，在40 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用2 mL體積分?jǐn)?shù)80%甲醇復(fù)溶，過0.22 μm有機(jī)濾膜，待測(cè)[10]。

表2 果肉渣發(fā)酵酒評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Criteria for sweet orange fermented wine

色譜條件[11]：色譜柱為Venusil MP C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量為20 μL，流速1 mL/min；流動(dòng)相A為1%冰乙酸溶液，B為甲醇。對(duì)于酚酸，洗脫程序?yàn)椋?～20 min，20%B；20～50 min，50%B；50～60 min，100%B；60～90 min，20%B；檢測(cè)波長(zhǎng)為260、320 nm。對(duì)于類黃酮，洗脫程序?yàn)椋?～30 min，25%～45%B；30～50 min，45%B；50～60 min，100%B；60～90 min，25%B；檢測(cè)波長(zhǎng)283、330 nm。

1.4 數(shù)據(jù)處理

將3次重復(fù)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用Design-Expert 8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)和結(jié)果分析，以O(shè)rigin 8.0.5繪圖軟件繪制試驗(yàn)結(jié)果圖，采用SPSS Statistics 25.0進(jìn)行差異性顯著分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 加水比例對(duì)果肉渣發(fā)酵酒的影響

不同加水比例對(duì)果肉渣發(fā)酵酒的影響如表3所示。當(dāng)加水比例為1∶0.5時(shí)，得酒率、黃酮與總酚含量較高，感官評(píng)分最高，果酒色澤良好，酒香濃郁協(xié)調(diào)。此后，加水比例越大，得酒率越高，但總酚和黃酮含量隨之降低，發(fā)酵所需糖分增大，生產(chǎn)成本增加，果酒中橘香味和酒香味降低，感官評(píng)分降低，口味寡淡。由于果肉渣本身水分含量較高，在固態(tài)發(fā)酵條件下(即加水比例為1∶0)仍能產(chǎn)生酒精，但得酒率較低，果肉渣中的多酚及類黃酮等物質(zhì)并未充分溶出，導(dǎo)致總酚與黃酮含量較低。因此確定加水比例為1∶0.5。

表3 加水比例對(duì)果肉渣發(fā)酵酒的影響Table 3 Effects of different material/water ratios on sweet orange fermented wine

注：每列中不同的字母表示顯著性差異。下同。(P<0.05)

2.1.2 菌種種類對(duì)果肉渣發(fā)酵酒的影響

不同的酵母菌種在發(fā)酵能力、產(chǎn)香等方面對(duì)果酒品質(zhì)具有重大影響[12]。如表4所示，果肉渣發(fā)酵酒的酒精度之間存在顯著性差異(P<0.05)。A1、A2、A6菌種發(fā)酵酒的總酚與黃酮含量低，口味寡淡，感官評(píng)分也較低；A3、A5菌種發(fā)酵酒的黃酮含量與感官評(píng)分較高，但酒精度與總酚含量低；而A4菌種發(fā)酵酒的總酚與黃酮含量較高，酒精度較高，為(11.57±0.04)%，感官評(píng)分最高為(84.51±0.9)分，酒體醇厚，柑橘香味與酒香味濃郁協(xié)調(diào)并且口感較佳，綜合分析，選擇A4菌種作為果肉渣發(fā)酵酒的酵母菌種。

表4 菌種種類對(duì)果肉渣發(fā)酵酒的影響Table 4 Effect of different species on sweet orange fermented wine

2.1.3 接種量對(duì)果肉渣發(fā)酵酒的影響

由圖1可知，隨著酵母接種量增大，酒精度與感官評(píng)分先上升后下降，當(dāng)酵母接種量為0.2%，酒精度最大值為11.4%。這是因?yàn)榻湍附臃N量低于0.2%時(shí)，酵母菌生長(zhǎng)緩慢，產(chǎn)生酒精速度慢，發(fā)酵周期延長(zhǎng)，口感欠佳；當(dāng)酵母接種量超過0.2%時(shí)，酵母生長(zhǎng)代謝旺盛,消耗發(fā)酵液中大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)導(dǎo)致酒精產(chǎn)量較低，同時(shí)過多的酵母菌殘留不利于果酒澄清并降低發(fā)酵酒的風(fēng)味與口感[13-14]?？偡优c黃酮均呈下降趨勢(shì)，黃酮含量在接種量超過0.2%后顯著降低(P<0.05)，其原因是酵母量增加，消耗了多酚及黃酮類物質(zhì)[15]。綜上考慮，選擇酵母接種量為0.1%～0.2%之間進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。

圖1 接種量對(duì)果肉渣發(fā)酵酒的影響Fig.1 Effect of inoculation amount on sweet orangefermented wine

2.1.4 初始糖度對(duì)果肉渣發(fā)酵酒的影響

由圖2可以看出，隨著初始糖度的增大，殘?zhí)橇恐饾u增加，酒精度與黃酮含量先升高后降低，總酚含量呈上升趨勢(shì)。當(dāng)初始糖度為22%時(shí)，酒精度與黃酮含量達(dá)到最大值，當(dāng)初始糖度低于22%時(shí)，由于糖分含量不足導(dǎo)致生成的酒精度較低，當(dāng)初始糖度超過22%時(shí)，過多的糖分增加發(fā)酵液的滲透壓，抑制了酵母菌的代謝活動(dòng)，酒精度與黃酮含量降低，發(fā)酵酒中糖含量增加，導(dǎo)致酒香味不突出，降低了發(fā)酵酒的感官品質(zhì)，與JOSHI等[16]報(bào)道的結(jié)果相類似。因此選擇初始糖度20%～24%進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖2 初始糖度對(duì)果肉渣發(fā)酵酒的影響Fig.2 Effect of initial sugar content on sweet orangefermented wine

2.1.5 溫度對(duì)果肉渣發(fā)酵酒的影響

一般果酒酵母發(fā)酵較適溫度范圍為25～30 ℃，溫度越高，酵母起酵越快，發(fā)酵周期越短[17]。由圖3可以看出，當(dāng)溫度低于28 ℃時(shí)，釀酒酵母生長(zhǎng)緩慢，殘?zhí)橇枯^高而導(dǎo)致酒精度較低，延長(zhǎng)了發(fā)酵時(shí)間。當(dāng)溫度高于28 ℃時(shí)，酵母菌繁殖迅速，衰老快，并且高溫下發(fā)酵酒中風(fēng)味物質(zhì)易揮發(fā)，生成的酒精度較低，酒體不濃郁，從而降低了發(fā)酵酒的口感與香氣。當(dāng)發(fā)酵溫度為28 ℃時(shí)，果肉渣發(fā)酵酒的酒精度、感官評(píng)分、黃酮含量較高，殘?zhí)橇孔畹?，發(fā)酵徹底并且酒體豐滿醇厚，而總酚含量變化差異不顯著(P>0.05)。因此選擇26～30 ℃進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。

圖3 溫度對(duì)果肉渣發(fā)酵酒的影響Fig.3 Effect of temperature on sweet orange fermented wine

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與方差分析

在分析上述各單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇接種量、初始糖度、發(fā)酵溫度3個(gè)因素為果肉渣發(fā)酵酒工藝的響應(yīng)變量，旨在保留果酒中的活性成分，同時(shí)果酒色香味俱全，因此以感官評(píng)分、黃酮和總酚含量為響應(yīng)指標(biāo)，對(duì)果肉渣發(fā)酵酒進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化和分析。試驗(yàn)方案和結(jié)果如表5所示。

表5 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 5 Experimental scheme and results for responsesurface analysis

表6 模型方差分析表Table 6 Analysis of variance of each model

注：“*”表示差異顯著(P<0.05);“**”表示差異極顯著(P<0.01)。

2.2.2 響應(yīng)面分析

在Y1模型中AB、AC交互作用不顯著，因此只對(duì)BC交互作用進(jìn)行分析，由圖4A可知，當(dāng)接種量一定時(shí)，發(fā)酵溫度與初始糖度的曲面較為陡峭，交互作用顯著。在Y2模型中BC、AB交互作用不顯著，因此只對(duì)AC交互作用進(jìn)行分析。由圖4B可知，當(dāng)初始糖度一定時(shí)，隨著發(fā)酵溫度與接種量的變化，黃酮含量的曲面曲率發(fā)生顯著性改變，二者對(duì)黃酮含量影響較大。在Y3模型中，AB、AC交互作用不顯著，故只對(duì)BC交互作用進(jìn)行分析，由圖4C可知，當(dāng)接種量一定時(shí)，發(fā)酵溫度和初始糖度逐漸增大時(shí)，總酚呈先升高后降低趨勢(shì)，說明交互作用相當(dāng)。

圖4 各因素對(duì)各指標(biāo)影響的響應(yīng)面Fig.4 Response surface of temperature and initial sugar content on sensory score(A), temperature and inoculationamount on flavonoids (B), temperature and initial sugar on total phenolic content(C)

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

感官評(píng)分與營(yíng)養(yǎng)價(jià)值是影響消費(fèi)者購買食品的關(guān)鍵因素，所以本試驗(yàn)中主要目的為釀造的甜橙果肉渣發(fā)酵酒色澤口感良好，酒體濃郁協(xié)調(diào)，同時(shí)在發(fā)酵過程中盡可能地保留了原料中的類黃酮等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)變廢為寶的效果。選擇感官評(píng)分的重要性為4，黃酮與總酚含量的重要性分別為3，選擇感官評(píng)分為目標(biāo)范圍69.5～85分中的最大響應(yīng)值，黃酮含量為目標(biāo)范圍110.75～125 mg/L中的最大響應(yīng)值，總酚含量為目標(biāo)范圍348.15～386.70 mg/L中的最大響應(yīng)值。通過Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得到果肉渣發(fā)酵酒的工藝條件為接種量0.19%、初始糖度23.79%、溫度29.71 ℃，在此條件下模型預(yù)測(cè)果肉渣發(fā)酵酒的感官評(píng)分為80.45分、黃酮與總酚含量分別為119.26、386.47 mg/L，考慮實(shí)際情況，確定最佳發(fā)酵工藝條件為接種量0.19%、初始糖度23.5%、溫度30 ℃，在此條件下，平行試驗(yàn)3次取平均值，所得果肉渣發(fā)酵酒感官評(píng)分為80.12分、黃酮與總酚含量分別為119.10、383.54 mg/L，試驗(yàn)得到的實(shí)際值與預(yù)測(cè)值接近，因此通過響應(yīng)面優(yōu)化果肉渣酒發(fā)酵條件是可行的。

2.4 品質(zhì)的分析比較

2.4.1 感官評(píng)價(jià)

在最優(yōu)工藝條件下，分別對(duì)果汁及果肉渣發(fā)酵酒進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，結(jié)果如圖5所示，果汁發(fā)酵酒澄清透亮，色澤良好，其色澤、澄清度方面高于果肉渣發(fā)酵酒。果肉渣發(fā)酵酒香氣濃郁，柑橘香味與酒香味協(xié)調(diào)，口感純正，回味持久，具有柑橘果酒的典型風(fēng)格，其香氣、口感、風(fēng)格分值均高于果汁發(fā)酵酒，與陳紅梅等[18]試驗(yàn)結(jié)果相似。

圖5 果酒感官評(píng)價(jià)結(jié)果Fig.5 Sensory evaluation results of fermented wine

2.4.2 酚類物質(zhì)含量分析

在最優(yōu)工藝條件下，分別測(cè)定各樣品中酚酸及類黃酮物質(zhì)含量，如表7所示，對(duì)應(yīng)色譜圖如圖6所示。由表7可知，6種酚酸中，果汁發(fā)酵酒中沒食子酸、綠原酸、咖啡酸含量均高于果肉渣發(fā)酵酒。對(duì)羥基苯甲酸在2種果酒中含量相當(dāng)，無顯著差異；相比于果汁發(fā)酵酒，果肉渣發(fā)酵酒中對(duì)香豆酸與阿魏酸的質(zhì)量濃度均高出2倍以上；在類黃酮物質(zhì)含量方面，果肉渣發(fā)酵酒中除香蜂草苷(3.92±0.06 mg/L)低于果汁發(fā)酵酒(4.17±0.04 mg/L)外，其余類黃酮物質(zhì)含量普遍高于果汁發(fā)酵酒。原因是采取帶渣發(fā)酵時(shí)果膠酶能促進(jìn)果渣細(xì)胞壁降解，有助于酚酸及黃酮類物質(zhì)從木質(zhì)素中釋放出來，從而增加了果酒中酚酸和類黃酮物質(zhì)的含量[19]。在發(fā)酵前后來看，果汁和果肉渣液經(jīng)過酒精發(fā)酵酚類物質(zhì)含量有所降低，與KELEBEK等[20]研究結(jié)果相似。果汁發(fā)酵前后除綠原酸含量升高外，其他物質(zhì)含量均為降低，而果肉渣液整體物質(zhì)含量下降不明顯，含量分別為(171.36±0.28)、(163.91±0.2) mg/L。

表7 果酒中單體酚類物質(zhì)含量Table 7 Content of monomer phenols in fermented wine

A-酚酸標(biāo)準(zhǔn)品及樣品HPLC圖；B-類黃酮標(biāo)準(zhǔn)品及樣品HPLC圖;1-沒食子酸；2-綠原酸；3-對(duì)羥基苯甲酸；4-咖啡酸；5-對(duì)香豆酸；6-阿魏酸；7-蕓香柚皮苷；8-蘆丁；9-橙皮苷；10-香蜂草苷；11-橘皮素圖6 11種酚類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品及樣品HPLC圖Fig.6 HPLC diagram of 11 phenolic substance standardsand fruit wine

3 結(jié)論

果肉渣發(fā)酵酒的最佳工藝條件為接種量0.19%、初始糖度23.5%、發(fā)酵溫度30 ℃，在此條件下，所得果肉渣發(fā)酵酒感官評(píng)分為80.12分、黃酮與總酚含量分別為119.10、383.54 mg/L。果汁發(fā)酵酒與果肉渣發(fā)酵酒的品質(zhì)分析表明，果肉渣發(fā)酵酒具有良好的柑橘香味，酒香醇厚，其中的酚酸和類黃酮物質(zhì)高于果汁發(fā)酵酒，含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。試驗(yàn)表明果肉渣發(fā)酵能獲得較高品質(zhì)的甜橙果酒。

本研究利用甜橙榨汁后的果肉渣，經(jīng)過酵母酒精發(fā)酵，充分消耗原料中的糖類，生產(chǎn)出具有更多功能性成分的果酒，為提高柑橘果酒品質(zhì)和充分利用柑橘加工副產(chǎn)物提供了新途徑，增加了柑橘加工產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。