李長(zhǎng)福，吳影,2,3，周子呂，曹力,3，王大紅,2，古紹彬,2,3*

1(河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽(yáng)，471023)2(河南省食品微生物工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽(yáng)，471023)3(食品加工與安全國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，河南 洛陽(yáng)，471023)

凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)是一種能產(chǎn)乳酸的革蘭氏陽(yáng)性菌，生長(zhǎng)繁殖迅速，兼具乳酸菌和芽孢桿菌的諸多益生特性[1]。凝結(jié)芽孢桿菌芽孢具有的優(yōu)良抗逆性使其可廣泛應(yīng)用于食品加工中，并能簡(jiǎn)化益生菌產(chǎn)品的存儲(chǔ)運(yùn)輸條件以及延長(zhǎng)貨架期[2]。益生菌要發(fā)揮其益生功能須能經(jīng)過(guò)極端酸環(huán)境的胃部到達(dá)弱酸環(huán)境(pH 4～6)的腸道內(nèi)進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，并保持足夠的活菌數(shù)[3]。人體胃液主要成分為胃酸，pH受個(gè)人身體狀況和飲食習(xí)慣影響，其空腹pH值約為2，進(jìn)食后由于稀釋作用可升至3.5[4]。食物進(jìn)入胃部后停留時(shí)間為1～3 h，只有極少部分能夠抵抗極端酸環(huán)境的微生物才能通過(guò)胃部發(fā)揮益生作用[5]。絕大多數(shù)的微生物因?yàn)槿狈δ褪艿蚿H環(huán)境的相關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)制，在經(jīng)胃部酸環(huán)境時(shí)大量H+進(jìn)入菌體細(xì)胞，引起細(xì)胞酸化，進(jìn)而影響細(xì)菌正常生長(zhǎng)與代謝，導(dǎo)致菌體死亡。

研究發(fā)現(xiàn)，營(yíng)養(yǎng)組成和培養(yǎng)條件對(duì)微生物的耐酸能力有顯著影響[6]。菌體細(xì)胞在酸性環(huán)境下保持胞內(nèi)pH穩(wěn)態(tài)的一個(gè)重要調(diào)節(jié)途徑是細(xì)胞膜對(duì)H+的低透過(guò)性。細(xì)菌受到酸環(huán)境刺激后細(xì)胞膜脂成分會(huì)發(fā)生相應(yīng)變化以抵御不良環(huán)境造成的影響。吳重德等[7]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸比例增加以及平均碳鏈增長(zhǎng)會(huì)降低細(xì)胞膜的流動(dòng)性，有利于細(xì)胞將過(guò)多的H+阻擋在胞外，維持胞內(nèi)pH穩(wěn)態(tài)，從而誘發(fā)干酪乳桿菌耐酸能力的變化。陳霞等[8]研究發(fā)現(xiàn)H+-ATPase與干酪乳桿菌耐酸性有關(guān)，一些陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶(如K+-ATP酶)可通過(guò)細(xì)胞H+和K+的交換，維持細(xì)胞內(nèi)pH的穩(wěn)定[9]。谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、精氨酸(Arg)、γ-氨基丁酸(GABA)、鳥(niǎo)氨酸(Orn)、天冬氨酸(Asp)、賴氨酸(Lys)等胞內(nèi)氨基酸水平發(fā)生變化，被認(rèn)為是微生物耐酸能力變化的主要代謝表征[3, 10-12]。

碳水化合物(碳源)是食物中三大營(yíng)養(yǎng)成分之一，其進(jìn)入腸道后也是腸道微生物生長(zhǎng)代謝過(guò)程中合成細(xì)胞碳架及為細(xì)胞生命活動(dòng)提供能量的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[13]。不同的碳水化合物及其分解產(chǎn)物，在腸道中與益生菌等腸道微生物接觸時(shí)，是否影響微生物生長(zhǎng)代謝行為及益生特性呢？眾所周知，由于基質(zhì)不同，所誘導(dǎo)微生物產(chǎn)生的代謝酶系也存在顯著差異，形成的代謝產(chǎn)物也可能存在較大差異，進(jìn)而誘發(fā)菌體呈現(xiàn)出不同的生理及代謝特征。本研究旨在通過(guò)實(shí)施胞外碳源擾動(dòng)實(shí)驗(yàn)，分析凝結(jié)芽孢桿菌在酸脅迫下生理代謝的響應(yīng)情況及耐酸能力變化情況，初步揭示碳源變化與菌體耐酸性能間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

凝結(jié)芽孢桿菌(BacilluscoagulansCGMCC 9951)，實(shí)驗(yàn)室分離保藏菌株。

液體培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖15，蛋白胨15，酵母粉10，MgSO45，pH 8.0。固體培養(yǎng)基再添加20 g/L的瓊脂粉。

不同碳源酸性培養(yǎng)基：以液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)將葡萄糖替換為其他相同質(zhì)量體積比(g∶L)的碳源(蔗糖、乳糖、麥芽糖、檸檬酸、果糖)，用稀鹽酸將pH調(diào)至pH 3.5。

ATP含量試劑盒、總蛋白定量測(cè)試盒(BCA法)：南京建成生物工程研究所；37種脂肪酸混標(biāo)：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；42種游離氨基酸混標(biāo)：德國(guó)曼默博爾公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A型氣相色譜儀(配FID氫火焰檢測(cè)器)，美國(guó)安捷倫科技有限公司；A300型全自動(dòng)氨基酸分析儀，德國(guó)曼默博爾公司；UV2100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，尤尼柯(上海)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC9951的培養(yǎng)

將凍存于-80 ℃的凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC 9951接種到培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)16～20 h，活化傳代2次，備用。

1.3.2 不同碳源耐酸性能檢測(cè)

取活化好的菌液，離心洗滌3次后用相同體積生理鹽水重懸。按3 %接種量分別接種于不同碳源的酸性培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3 h，然后取樣采用平板稀釋涂布法進(jìn)行涂布計(jì)數(shù)。

1.3.3 胞內(nèi)氨基酸測(cè)定

取20 mL活化好的菌液，離心洗滌后加入不同碳源的酸性培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 h，然后用磷酸緩沖液離心洗滌(3 000 r/min，4 ℃，5 min)3次，棄上清重懸于1 mL相同緩沖液中。沸水浴15 min，離心(112 40 r/min,4 ℃,10 min)，取上清800 μL，加200 μL 100 g/L磺基水楊酸，混合均勻。4 ℃靜置60 min，14 500 r/min冷凍離心15 min，取上清相同操作離心5 min，用樣品稀釋液等比例稀釋后經(jīng)0.22 μm過(guò)濾器過(guò)濾后上機(jī)分析。氨基酸含量表示為每克細(xì)胞(干重)所含氨基酸數(shù)，μg/g。

1.3.4 ATP含量測(cè)定

根據(jù)ATP含量測(cè)定試劑盒所提供的試驗(yàn)方法和步驟測(cè)定凝結(jié)芽孢桿菌酸培養(yǎng)3 h后胞內(nèi)ATP的含量。ATP含量表示為μmol/g prot。

1.3.5 細(xì)胞膜脂肪酸測(cè)定前處理

取20 mL活化好的菌體，加入不同碳源酸性培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 h，然后用超純水離心洗滌(10 000 r/min，4 ℃，5 min)3次，棄上清后向沉淀中加入1.5 mL 1 mol/L 甲醇鈉振蕩1.5 min，4 ℃靜置10 min，加入1 mL 正己烷，振蕩1 min，靜置5 min，取上層有機(jī)相過(guò)膜后上機(jī)測(cè)定細(xì)胞膜脂肪酸。碳鏈長(zhǎng)度參考文獻(xiàn)[7]的方法進(jìn)行。

1.3.6 氣相色譜檢測(cè)

采用安捷倫7890A型氣相色譜儀。色譜柱：HP-88毛細(xì)管柱(60 m×0.25 mm，0.20 μm)；升溫程序：程序升溫至140 ℃保持5 min，以2.5 ℃/min速率升至180 ℃保持3 min，然后1 ℃/min升至196 ℃保持10 min，最后5 ℃/min升至240 ℃保持10 min；載氣N2，進(jìn)樣量1 μL。定性采用標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照法，定量采用面積歸一化法。

1.4 數(shù)據(jù)處理

圖表采用OriginPro 2017軟件繪制，數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 22軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多重比較采用Duncan新復(fù)極差法分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源對(duì)酸脅迫下凝結(jié)芽孢桿菌存活的影響

如圖1所示，酸脅迫下，添加不同碳源的凝結(jié)芽孢桿菌耐酸能力依次是：果糖>葡萄糖>蔗糖>麥芽糖>檸檬酸>乳糖。其中，以果糖作為碳源時(shí)，菌體的耐酸能力與對(duì)照組相比提高了21%，是蔗糖組的1.69倍，檸檬酸組的27.84倍，乳糖組的35.63倍。楊郁等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在人工胃液中添加葡萄糖后，干酪乳桿菌T-32的存活率比未添加葡萄糖的對(duì)照組提高了118.10倍。郭澤鑌[14]研究發(fā)現(xiàn)，在pH 2.5酸性處理3 h 的條件下，超高壓處理后的蓮子淀粉可使雙歧桿菌存活率由葡萄糖組的61.31%提高至72.84%。由此可見(jiàn)，碳源種類(lèi)對(duì)菌體的耐酸能力有直接影響?？赡苡捎诓煌荚催M(jìn)入細(xì)胞后誘導(dǎo)微生物產(chǎn)生的代謝酶系存在顯著差異，其在胞內(nèi)的代謝途徑及形成的代謝產(chǎn)物也存在較大差異，引起與酸耐受直接相關(guān)的能量代謝水平，細(xì)胞膜脂組成，胞內(nèi)氨基酸代謝等的顯著變化，從而使菌體酸耐受能力發(fā)生改變。

2.2 不同碳源對(duì)酸脅迫下凝結(jié)芽孢桿菌胞內(nèi)ATP含量的影響

碳源為微生物的生命活動(dòng)提供所需的能量。有報(bào)道指出乳酸菌在酸性環(huán)境中可利用質(zhì)子泵F0F1-ATPase消耗能量ATP排出胞內(nèi)H+，維持胞質(zhì)pH正常[11]。酸脅迫下，不同碳源對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌胞ATP含量的影響如圖2所示，以蔗糖和果糖作為碳源時(shí)，胞內(nèi)ATP含量較高，分別達(dá)到了6.925 0 μmol/g prot

圖1 不同碳源對(duì)酸脅迫下凝結(jié)芽孢桿菌存活的影響Fig.1 Effects of different carbon sources on the survivalof Bacillus coagulans under acids tress注：“*”代表差異顯著.P<0.05；“**”代表差異極顯著，P<0.01。

和5.818 1 μmol/g prot，檸檬酸組ATP含量最低，為0.828 2 μmol/g prot。其中果糖組ATP含量是葡萄糖組1.95倍，是檸檬酸組7.02倍。由于蔗糖水解為葡萄糖和果糖后分別進(jìn)入葡萄糖代謝途徑和果糖代謝途徑，果糖代謝不經(jīng)過(guò)糖酵解途徑中由磷酸果糖激酶(EC∶2.7.1.11)催化的限速反應(yīng)步驟，同時(shí)1-磷酸果糖是丙酮酸激酶(EC∶2.7.1.40)的激動(dòng)劑，產(chǎn)生大量的ATP[15]。半乳糖則需經(jīng)5步反應(yīng)才能生成葡萄糖-6-磷酸，產(chǎn)生ATP，因此ATP生成速率受到一定影響。盡管檸檬酸是三羧酸循環(huán)中的中間物質(zhì)，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在所有碳源中檸檬酸所產(chǎn)生的ATP含量最低，主要是高濃度的檸檬酸對(duì)菌體產(chǎn)生明顯的抑菌作用[16]。KOPONEN等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在酸脅迫下，乳酸菌F0F1-ATPase酶中F1復(fù)合體的全部或部分亞單位表達(dá)均上調(diào)。KULLEN等[17]證實(shí)，pH 3.5的酸脅迫處理嗜熱乳桿菌60 min，可使嗜熱乳桿菌F0F1-ATPase轉(zhuǎn)錄水平提高約2倍。因此，酸脅迫下，高水平的F0F1-ATPase表達(dá)量和高濃度的ATP能量水平對(duì)維持胞內(nèi)穩(wěn)定的pH環(huán)境，提高菌體耐酸能力具有重要作用；不同碳源由于其代謝方式不同，產(chǎn)生ATP的含量和速率有一定差異，進(jìn)而影響菌體對(duì)酸脅迫的耐受能力。

圖2 不同碳源對(duì)酸脅迫下凝結(jié)芽孢桿菌胞內(nèi)ATP含量的影響Fig.2 Effects of different carbon sources on intracellularATP content of Bacillus coagulans under acid stress注：圖中不同小寫(xiě)字母代表差異顯著，P<0.05。

2.3 不同碳源對(duì)酸脅迫下凝結(jié)芽孢桿菌膜脂組成的影響

脂肪酸是細(xì)胞膜的重要組成成分，脂肪酸的比例以及飽和程度等對(duì)細(xì)胞膜的流動(dòng)性和通透性具有顯著影響[18]，而細(xì)胞膜的流動(dòng)性和通透性對(duì)細(xì)胞的新陳代謝和維持細(xì)胞穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。表1為酸脅迫下不同碳源對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌細(xì)胞膜脂肪酸組成及百分含量，與正常培養(yǎng)(pH 8.0)的對(duì)照組相比，酸脅迫組的脂肪酸組成發(fā)生了較大變化，其中以果糖、乳糖等為碳源時(shí)，十七烷酸百分含量分別增加至61.87%和61.70%，總飽和脂肪酸(SFA)百分含量分別下降為73.51%和73.67%，總不飽和脂肪酸(UFA)百分含量分別上升至26.49%和26.33%，SFA/UFA比值下降至2.77和2.80，平均碳鏈長(zhǎng)度分別增長(zhǎng)至16.18和16.17。BROWN和楊揚(yáng)等[19-20]發(fā)現(xiàn),十七烷酸含量的顯著增加能夠提高大腸桿菌耐酸能力及抗高密度二氧化碳(DPCD)脅迫。吳重德等[7]證實(shí)酸脅迫干酪乳桿菌45 min后，細(xì)胞膜脂碳鏈長(zhǎng)度由15.55增加至16.53。SCHOUG等[21]觀察到棒狀乳桿菌pH值從5.5降至4.5后，SFA/UFA比值由0.86下降至0.51，可減少由酸脅迫引起的氧應(yīng)激對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的損傷[7]。楊旭[22]研究發(fā)現(xiàn)，脂肪酸平均碳鏈長(zhǎng)度增長(zhǎng)將有助于雙歧桿菌提高酸抵抗能力，主要是由于長(zhǎng)鏈更容易跨越磷脂雙分子層使膜趨于凝膠狀，從而促使細(xì)胞膜流動(dòng)性降低。因此，酸脅迫后細(xì)菌凝結(jié)芽孢桿菌細(xì)胞膜SFA/UFA比值下降及平均碳鏈長(zhǎng)度增長(zhǎng)，都導(dǎo)致細(xì)胞膜的流動(dòng)性降低，從而有利于細(xì)胞將過(guò)多的H+阻擋在胞外，維持胞內(nèi)pH穩(wěn)態(tài)。

2.4 不同碳源對(duì)酸脅迫下凝結(jié)芽孢桿菌胞內(nèi)氨基酸含量的影響

研究發(fā)現(xiàn)，胞內(nèi)較高的Glu、Gln、Arg、Orn等氨基酸水平對(duì)提高微生物抵御環(huán)境脅迫的能力及調(diào)控胞內(nèi)pH穩(wěn)定等具有重要作用[23]。酸脅迫下，不同碳源對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌胞內(nèi)氨基酸水平的影響如表2所示，以果糖為碳源時(shí)，與酸耐受性相關(guān)的6種氨基酸Glu、Gln、Arg、Orn、Asp和Lys的含量均顯著高于其他5組(P<0.05)，分別達(dá)到了597.23、44.30、167.16、127.98、178.46和409.05 μg/g。蔗糖組中，上述6種氨基酸含量均顯著高于麥芽糖、檸檬酸和乳糖組。而當(dāng)以乳糖為碳源時(shí)，Asp、Arg、Lys含量最低，僅為54.94、69.24和158.75 μg/g。結(jié)合圖1結(jié)果分析，不難發(fā)現(xiàn)，不同碳源條件下，菌體耐酸能力與上述氨基酸的胞內(nèi)水平呈現(xiàn)明顯相關(guān)性。

表1 不同碳源對(duì)酸脅迫下凝結(jié)芽孢桿菌膜脂組成的影響Table 1 Effects of different carbon sources on membrane lipid composition of Bacillus coagulans under acid stress

注：C6∶0，己酸；C8∶0，辛酸；C14∶0，肉豆蔻酸；C14∶1，肉豆蔻烯酸；C15∶1，十五碳烯酸；C16∶0，棕櫚酸；C16∶1，棕櫚油酸；C17∶0，十七烷酸；C18∶0，硬脂酯酸；C18∶1T，反油酸；C18∶1，油酸；SFA，飽和脂肪酸；UFA，不飽和脂肪酸；“-”表示未檢出；同行不同字母表示差異顯著水平(P<0.05)。下同。

表2 不同碳源對(duì)酸脅迫下凝結(jié)芽孢桿菌胞內(nèi)氨基酸含量的影響Table 2 Effects of different carbon sources on intracellular amino acid content of Bacillus coagulans under acid stress

3 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)，在酸性環(huán)境下，不同碳源可通過(guò)影響凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC9951細(xì)胞膜成分及組成比例，增加十七烷酸和總不飽和脂肪酸含量，提高胞內(nèi)ATP含量，產(chǎn)生更高水平的與耐酸相關(guān)氨基酸(如Glu、Arg、Asp、Lys)等方式提高凝結(jié)芽孢桿菌耐酸能力。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，由于果糖代謝可不經(jīng)過(guò)磷酸果糖激酶催化的限速反應(yīng)，且1-磷酸果糖是丙酮酸激酶的激動(dòng)劑，從而加速果糖在體內(nèi)的代謝速率，這對(duì)提高菌體的耐酸能力具有重要作用。因此，在使用凝結(jié)芽孢桿菌時(shí)，輔以果糖或含有果糖的食物可大幅度提高凝結(jié)芽孢的酸抵抗能力，這將有利于其進(jìn)入腸道發(fā)揮益生作用。

此外，大量實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)酸脅迫使菌體產(chǎn)生應(yīng)激蛋白，同時(shí)菌體通過(guò)質(zhì)子泵排出H+和產(chǎn)生堿性物質(zhì)中和胞內(nèi)過(guò)多的H+過(guò)程均需要特定酶的參與來(lái)完成；有關(guān)凝結(jié)芽孢桿菌在酸性環(huán)境下哪種應(yīng)激蛋白、伴侶蛋白和產(chǎn)堿酶參與耐酸調(diào)控，這都將是本研究在后續(xù)工作中持續(xù)關(guān)注的問(wèn)題。