王遠玭、吳煒綜述,張抒揚審校
2001年,Young等[1]利用酵母雙雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)了一種與肌聯(lián)蛋白作用的大分子蛋白,命名為obscurin,自此揭開了obscurin作為橫紋肌細胞內(nèi)第三大骨架分子的重要作用。Obscurin是對OBSCN基因表達的一系列蛋白分子的總稱,主要存在于脊椎動物橫紋肌組織中。OBSCN基因含119個外顯子,通過選擇性剪接的方式產(chǎn)生多種轉(zhuǎn)錄本,從而得到一個分子量跨度極大的蛋白質(zhì)族群[2]。Obscurin存在兩種大分子同種型,即obscurin-A及obscurin-B,主要分布于人體骨骼肌及心肌細胞中,參與肌節(jié)形成及肌漿網(wǎng)結(jié)構(gòu)的維持;近年來也有研究表明,obscurin還參與細胞內(nèi)鈣循環(huán)調(diào)節(jié)及信號轉(zhuǎn)導等[3]。目前發(fā)現(xiàn),OBSCN基因突變可以導致多種心肌病,主要是肥厚型心肌病、擴張型心肌病、左心室致密化不全等[4]。
伴隨著人類基因組計劃的完成,人們對新基因的發(fā)現(xiàn)和認識出現(xiàn)了爆發(fā)式增長。2001年,Young等[1]發(fā)現(xiàn)了一種與肌聯(lián)蛋白相互作用的未知蛋白,以酵母陽性克隆中分離到的一個長750 bp 的互補DNA(cDNA)序列為基礎(chǔ),在已報道的cDNA庫中通過雙向延長、序列比對,推斷出一個全新基因的序列信息及未知蛋白的大致結(jié)構(gòu),將其命名為obscurin,并初步進行了結(jié)構(gòu)域編碼。Russell等[5]分離出長度為600 bp、被認為編碼與肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)相似結(jié)構(gòu)域的人心肌cDNA克隆,發(fā)現(xiàn)其實際編碼了obscurin C末端的一個結(jié)構(gòu)域,據(jù)此成功將OBSCN基因定位于1q42.13。2004年人類基因組計劃最終數(shù)據(jù)發(fā)表后,OBSCN基因及obscurin蛋白結(jié)構(gòu)域的命名也經(jīng)歷了一次更新,最終確定了這個大小約190 kb、含119個外顯子的巨大基因的序列信息,并推斷出obscurin可能的結(jié)構(gòu)域,按順序重新編號命名[2]。
根據(jù)OBSCN基因的序列信息及基因序列-蛋白結(jié)構(gòu)關(guān)聯(lián),可以推斷出obscurin為含65個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域、2個纖連蛋白結(jié)構(gòu)域、能與鈣調(diào)蛋白結(jié)合的IQ結(jié)構(gòu)域和RhoGEF結(jié)構(gòu)域、SH3結(jié)構(gòu)域、DH結(jié)構(gòu)域、PH結(jié)構(gòu)域等的大分子蛋白。OBSCN基因序列中含有多個剪接位點,可以推測該基因表達的蛋白可能存在多種同種型,機體通過選擇性剪接的機制來調(diào)控[2]。此前人們就發(fā)現(xiàn),obscurin存在兩種不同的大分子型,通過選擇性剪接得到C末端截然不同的信使RNA;而根據(jù)基因中剪接位點的分布,推測可能存在外顯子2與77融合而成的小分子型obscurin A(mini A)[2]。這個猜想在后續(xù)的研究中得到了驗證。Ackermann等[6-7]發(fā)現(xiàn),抗α錨蛋白結(jié)合域抗體可使心肌閏盤著色,提示此處可能富集了某種obscurin蛋白亞型,并通過實時熒光定量PCR、蛋白質(zhì)免疫印跡等方法證實了兩種全新的小分子型即obscurin-40和obscurin-80的存在。目前NCBI及Ensembl數(shù)據(jù)庫中收錄的obscurin蛋白同種型多達十余種,尚不包括少數(shù)可疑但尚未被驗證的同種型,其分子大小跨度極大(20~950 kDa)[6]。根據(jù)分子大小可以將obscurin蛋白同種型分為大分子(720~900 kDa)、中等大小分子(150~500 kDa)及小分子(<150 kDa)[7]。根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)域的特點又可將其分為obscurin-A、obscurin-B及其他小分子型。Obscurin-A和obscurin-B是主要的兩種類型,也是目前研究較深入的同種型。二者均屬大分子同種型,主要區(qū)別在于C端:obscurin-A含GEF/PH結(jié)構(gòu)域,C末端有錨蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域;obscurin-B則不含上述結(jié)構(gòu)域,取而代之的是兩個MLCK結(jié)構(gòu)域[2]。
OBSCN基因主要在人體的心肌及骨骼肌組織中表達,在其他組織中幾乎不表達,利用RNA印跡法可檢測到不同分子量的轉(zhuǎn)錄本[5]。表觀遺傳學研究表明,在胚胎分化為成肌細胞之前,OBSCN基因處于高度甲基化狀態(tài),而在成肌纖維過程中發(fā)生活躍的去甲基化過程而使基因處于低甲基化狀態(tài),細胞通過甲基化-去甲基化作用調(diào)控OBSCN基因的時間特異性表達[8]。Ackermann等[6]通過蛋白質(zhì)免疫印跡及免疫組化的方法,系統(tǒng)性揭示出obscurin可能的同種型及其組織表達差異、細胞內(nèi)分布差異等信息。該研究團隊發(fā)現(xiàn),obscurin在腦、腎、脾、皮膚等組織器官中也有表達,但與骨骼肌、心肌中表達的蛋白亞型不同;其中大分子型obscurin-A及obscurin-B主要存在于骨骼肌、心肌組織中,中小分子亞型則廣泛見于多種器官組織;在骨骼肌和心肌細胞中,obscurin主要分布于肌節(jié)、肌漿網(wǎng),在細胞核、毛細血管內(nèi)皮周圍也有某些亞型分布。
Obscurin的分子量僅次于肌聯(lián)蛋白和伴肌動蛋白,三者合稱為肌細胞內(nèi)的三大細胞骨架分子,主要存在于肌節(jié)之中[9]。Obscurin-A是肌細胞中的優(yōu)勢同種型,被認為在肌纖維形成、肌漿網(wǎng)發(fā)育中起到重要作用,因此又有分子向?qū)еQ。而obscurin-B的細胞表達量較低,但在心肌細胞中,存在大量帶單個或串聯(lián)MLCK結(jié)構(gòu)域的obscurin小分子型,它們的作用尚不明確。
Obscurin參與橫紋肌纖維形成。在肌纖維橫紋化的過程中,obscurin在細胞內(nèi)的定位發(fā)生動態(tài)變化。胚胎發(fā)育過程中,成肌細胞內(nèi)最早形成的是線性連續(xù)性的肌動蛋白絲,輔肌動蛋白也呈線性分布。此時,肌細胞中幾乎檢測不到obscurin。隨后,肌聯(lián)蛋白與obscurin幾乎同時或先后組裝上去,肌聯(lián)蛋白與肌動蛋白絲延伸方向平行,跨越整個肌節(jié),而obscurin與肌動蛋白絲垂直,主要集中于M線及新生肌節(jié)的Z盤水平。Obscurin出現(xiàn)后,輔肌動蛋白的分布也隨之發(fā)生變化,呈橫紋狀集中分布于Z盤水平[10-11]。Obscurin在A帶M線表達后,引導肌球蛋白組裝至A帶。利用病毒轉(zhuǎn)染使早期肌細胞過表達obscurin的C端,可導致A帶中的肌球蛋白量明顯減少,而肌間蛋白不受明顯影響[12]。通過利用病毒轉(zhuǎn)染小干擾RNA靶向干擾obscurin的第一個編碼外顯子,從而降低obscurin表達量,有研究者發(fā)現(xiàn),雖然輔肌動蛋白仍能實現(xiàn)橫紋化分布,但肌纖維更容易出現(xiàn)分叉、零散、多分支現(xiàn)象,肌球蛋白彌漫分布,肌細胞無法有效收縮[13]。與此同時,obscurin與肌漿網(wǎng)特異的錨蛋白(Ank 1.5) 作用,引導肌漿網(wǎng)在Z盤水平的集中分布及肌節(jié)間縱向延伸。特異性敲除OBSCN基因的純合子小鼠心肌組織電鏡切片后,發(fā)現(xiàn)其縱向延伸至M線的肌漿網(wǎng)顯著減少[14]。
2017年,有報道提出,obscurin與肌細胞內(nèi)鈣循環(huán)的建立密切相關(guān),并首次發(fā)現(xiàn)了obscurin突變與心肌細胞電活動異常的相關(guān)性[15]。OBSCN基因R4344Q突變在一肥厚型心肌病家系中被證明有致病性[16]。在特異性敲入該位點突變的純合子小鼠模型中觀察到,靜息狀態(tài)下1歲的小鼠心肌大體結(jié)構(gòu)無明顯變化,但心電監(jiān)護顯示突變小鼠的基礎(chǔ)心率更快,更容易出現(xiàn)自發(fā)室性心律失常。對鈣循環(huán)相關(guān)蛋白的檢測提示,肌漿網(wǎng)鈣泵2a表達量升高,而受磷蛋白(PLN)五聚體明顯下降,肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣儲量增加,從而引起鈣電流的不穩(wěn)定;其作用機制可能與突變結(jié)構(gòu)域Ig58與PLN作用增強有關(guān);在長期不穩(wěn)定鈣電流刺激下,心室出現(xiàn)重構(gòu),繼發(fā)心肌肥厚或心室擴大[15]。
此外,obscurin-A含有的RhoGEF結(jié)構(gòu)域被認為參與Ras同源基因家族成員A(RhoA)-Rho相關(guān)螺旋卷曲蛋白激酶1(ROCK1)/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(CRIK)信號通路的調(diào)控,從而介導心肌肥厚[17]。Obscurin將Ank 1.5聚集于M線水平抑制鉀離子通道四聚化結(jié)構(gòu)域-6蛋白(KCTD6)介導的錨蛋白降解[18]。體外動物實驗發(fā)現(xiàn),位于心肌細胞閏盤中的obscurin小分子型過表達可引起心肌細胞連接松散、細胞體積縮小,可能與小分子型通過PH結(jié)構(gòu)域與細胞膜上的磷脂酰肌醇-4, 5-二磷酸(PIP2)結(jié)合,調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路的激活相關(guān)[7]。更多的obscurin分子型功能尚待進一步研究。
目前明確,與OBSCN基因突變相關(guān)的疾病主要為遺傳性心肌病、肌病等。2007年,一名日本青年被發(fā)現(xiàn)攜帶R4344Q雜合突變并表現(xiàn)為肥厚型心肌病[16]。有研究人員利用全外顯子組測序技術(shù),在74例中國散發(fā)性肥厚型心肌病患者中鑒定出6個全新的罕見OBSCN基因變異,均為雜合子致病,其中4個為靠近N端的移碼突變,2個為靠近C端的點突變,而在2 000例正常對照者中不存在上述變異,因此這些基因變異高度可疑致病,但具體致病機制尚不明確[19]。在一項對30例擴張型心肌病終末期患者心肌樣本進行全外顯子組測序的研究中,4個樣本檢測出OBSCN基因突變,其中3個考慮為可疑的致病突變,導致obscurin表達量明顯下降(為對照組的45%~72%),而正常對照、非OBSCN基因突變的擴張型心肌病及肥厚型心肌病患者之間的obscurin表達量無明顯差異,提示OBSCN基因突變可能通過單倍體不足的機制致病[20]。在左心室致密化不全、遠端肌萎縮等疾病中,也有少數(shù)OBSCN基因突變的報道。Rowland等[21]在10例左心室致密化不全患者中檢測到3個全新的OBSCN基因突變,包含2個移碼突變和1個剪接突變,突變位點均集中于obscurin-B特有的C末端。在一個法國家系中,同時攜帶OBSCN c. 13330C>T和FLNC c.5161delG突變的患者表現(xiàn)為遠端肌萎縮,較此前保加利亞家系中報道過的FLNC c. 5160delC致病的外顯率更高,發(fā)病年齡更早,檢測發(fā)現(xiàn)患者體內(nèi)的突變型obscurin與肌聯(lián)蛋白的結(jié)合力下降約15倍,可能通過降低肌纖維的穩(wěn)定性而促進遠端肌萎縮的發(fā)病[22]。Forleo等[23]利用靶基因測序技術(shù),在8例致心律失常性右心室心肌病患者中,檢測出其中2例有3個OBSCN基因變異,其中OBSCN c. 17371G>C為可疑的致病突變,但缺乏進一步的功能驗證研究。此外,有臨床研究表明,攜帶OBSCN基因突變的乳腺癌患者在接受化療或靶向治療過程中更容易出現(xiàn)左心室射血分數(shù)下降甚至擴張型心肌病[24],提示OBSCN基因的多態(tài)性在腫瘤心臟病學研究中亦是不可忽視的一部分?;熛嚓P(guān)的心臟毒性生物標志物,包括一些應用轉(zhuǎn)錄組學或代謝組學檢測到的標記分子,作為早期識別和診斷化療期間心臟毒性的重要手段,正逐漸被臨床認可和重視[25]。如果能從基因水平識別出化療相關(guān)心臟毒性的高危人群,就能預先針對性地調(diào)整化療方案和采取預防措施,達到精準醫(yī)療的目的。
綜上所述,obscurin在心肌的發(fā)育及正常結(jié)構(gòu)功能的維持中發(fā)揮著重要的作用。關(guān)于obscurin的功能,仍有許多尚未明確的機制值得進一步深入研究,包括其不同分子型的表達調(diào)控及功能差異、對肌細胞電活動及細胞間連接穩(wěn)定性的影響等。隨著測序技術(shù)的發(fā)展,發(fā)現(xiàn)許多不明原因的心肌病患者中存在多種多樣的OBSCN基因變異,但大多缺乏有關(guān)其致病性及致病機制的深入研究?;驒z測對于遺傳性心肌病的早期診斷、治療和預后的意義日益顯著,在探索疾病發(fā)病機制、危險分層和指導優(yōu)生優(yōu)育方面有不可替代的作用[26],而由于OBSCN基因序列長,功能區(qū)復雜,可能存在許多并不具有致病性的單核苷酸多態(tài)性,需要進一步研究,以明確OBSCN基因變異與心肌病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系,探究其可能的致病機制,尋找藥物治療、基因治療的靶點等。
利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突