王遠玭、吳煒綜述，張抒揚審校

2001年，Young等[1]利用酵母雙雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)了一種與肌聯(lián)蛋白作用的大分子蛋白，命名為obscurin，自此揭開了obscurin作為橫紋肌細胞內(nèi)第三大骨架分子的重要作用。Obscurin是對OBSCN基因表達的一系列蛋白分子的總稱，主要存在于脊椎動物橫紋肌組織中。OBSCN基因含119個外顯子，通過選擇性剪接的方式產(chǎn)生多種轉(zhuǎn)錄本，從而得到一個分子量跨度極大的蛋白質(zhì)族群[2]。Obscurin存在兩種大分子同種型，即obscurin-A及obscurin-B，主要分布于人體骨骼肌及心肌細胞中，參與肌節(jié)形成及肌漿網(wǎng)結(jié)構(gòu)的維持；近年來也有研究表明，obscurin還參與細胞內(nèi)鈣循環(huán)調(diào)節(jié)及信號轉(zhuǎn)導等[3]。目前發(fā)現(xiàn)，OBSCN基因突變可以導致多種心肌病，主要是肥厚型心肌病、擴張型心肌病、左心室致密化不全等[4]。

1 OBSCN基因的發(fā)現(xiàn)

伴隨著人類基因組計劃的完成，人們對新基因的發(fā)現(xiàn)和認識出現(xiàn)了爆發(fā)式增長。2001年，Young等[1]發(fā)現(xiàn)了一種與肌聯(lián)蛋白相互作用的未知蛋白，以酵母陽性克隆中分離到的一個長750 bp 的互補DNA（cDNA）序列為基礎(chǔ)，在已報道的cDNA庫中通過雙向延長、序列比對，推斷出一個全新基因的序列信息及未知蛋白的大致結(jié)構(gòu)，將其命名為obscurin，并初步進行了結(jié)構(gòu)域編碼。Russell等[5]分離出長度為600 bp、被認為編碼與肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）相似結(jié)構(gòu)域的人心肌cDNA克隆，發(fā)現(xiàn)其實際編碼了obscurin C末端的一個結(jié)構(gòu)域，據(jù)此成功將OBSCN基因定位于1q42.13。2004年人類基因組計劃最終數(shù)據(jù)發(fā)表后，OBSCN基因及obscurin蛋白結(jié)構(gòu)域的命名也經(jīng)歷了一次更新，最終確定了這個大小約190 kb、含119個外顯子的巨大基因的序列信息，并推斷出obscurin可能的結(jié)構(gòu)域，按順序重新編號命名[2]。

2 Obscurin的結(jié)構(gòu)及分布

根據(jù)OBSCN基因的序列信息及基因序列-蛋白結(jié)構(gòu)關(guān)聯(lián)，可以推斷出obscurin為含65個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域、2個纖連蛋白結(jié)構(gòu)域、能與鈣調(diào)蛋白結(jié)合的IQ結(jié)構(gòu)域和RhoGEF結(jié)構(gòu)域、SH3結(jié)構(gòu)域、DH結(jié)構(gòu)域、PH結(jié)構(gòu)域等的大分子蛋白。OBSCN基因序列中含有多個剪接位點，可以推測該基因表達的蛋白可能存在多種同種型，機體通過選擇性剪接的機制來調(diào)控[2]。此前人們就發(fā)現(xiàn)，obscurin存在兩種不同的大分子型，通過選擇性剪接得到C末端截然不同的信使RNA；而根據(jù)基因中剪接位點的分布，推測可能存在外顯子2與77融合而成的小分子型obscurin A（mini A）[2]。這個猜想在后續(xù)的研究中得到了驗證。Ackermann等[6-7]發(fā)現(xiàn)，抗α錨蛋白結(jié)合域抗體可使心肌閏盤著色，提示此處可能富集了某種obscurin蛋白亞型，并通過實時熒光定量PCR、蛋白質(zhì)免疫印跡等方法證實了兩種全新的小分子型即obscurin-40和obscurin-80的存在。目前NCBI及Ensembl數(shù)據(jù)庫中收錄的obscurin蛋白同種型多達十余種，尚不包括少數(shù)可疑但尚未被驗證的同種型，其分子大小跨度極大（20～950 kDa）[6]。根據(jù)分子大小可以將obscurin蛋白同種型分為大分子（720～900 kDa）、中等大小分子（150～500 kDa）及小分子（＜150 kDa）[7]。根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)域的特點又可將其分為obscurin-A、obscurin-B及其他小分子型。Obscurin-A和obscurin-B是主要的兩種類型，也是目前研究較深入的同種型。二者均屬大分子同種型，主要區(qū)別在于C端：obscurin-A含GEF/PH結(jié)構(gòu)域，C末端有錨蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域；obscurin-B則不含上述結(jié)構(gòu)域，取而代之的是兩個MLCK結(jié)構(gòu)域[2]。

OBSCN基因主要在人體的心肌及骨骼肌組織中表達，在其他組織中幾乎不表達，利用RNA印跡法可檢測到不同分子量的轉(zhuǎn)錄本[5]。表觀遺傳學研究表明，在胚胎分化為成肌細胞之前，OBSCN基因處于高度甲基化狀態(tài)，而在成肌纖維過程中發(fā)生活躍的去甲基化過程而使基因處于低甲基化狀態(tài)，細胞通過甲基化-去甲基化作用調(diào)控OBSCN基因的時間特異性表達[8]。Ackermann等[6]通過蛋白質(zhì)免疫印跡及免疫組化的方法，系統(tǒng)性揭示出obscurin可能的同種型及其組織表達差異、細胞內(nèi)分布差異等信息。該研究團隊發(fā)現(xiàn)，obscurin在腦、腎、脾、皮膚等組織器官中也有表達，但與骨骼肌、心肌中表達的蛋白亞型不同；其中大分子型obscurin-A及obscurin-B主要存在于骨骼肌、心肌組織中，中小分子亞型則廣泛見于多種器官組織；在骨骼肌和心肌細胞中，obscurin主要分布于肌節(jié)、肌漿網(wǎng)，在細胞核、毛細血管內(nèi)皮周圍也有某些亞型分布。

3 Obscurin的功能

Obscurin的分子量僅次于肌聯(lián)蛋白和伴肌動蛋白，三者合稱為肌細胞內(nèi)的三大細胞骨架分子，主要存在于肌節(jié)之中[9]。Obscurin-A是肌細胞中的優(yōu)勢同種型，被認為在肌纖維形成、肌漿網(wǎng)發(fā)育中起到重要作用，因此又有分子向?qū)еQ。而obscurin-B的細胞表達量較低，但在心肌細胞中，存在大量帶單個或串聯(lián)MLCK結(jié)構(gòu)域的obscurin小分子型，它們的作用尚不明確。

Obscurin參與橫紋肌纖維形成。在肌纖維橫紋化的過程中，obscurin在細胞內(nèi)的定位發(fā)生動態(tài)變化。胚胎發(fā)育過程中，成肌細胞內(nèi)最早形成的是線性連續(xù)性的肌動蛋白絲，輔肌動蛋白也呈線性分布。此時，肌細胞中幾乎檢測不到obscurin。隨后，肌聯(lián)蛋白與obscurin幾乎同時或先后組裝上去，肌聯(lián)蛋白與肌動蛋白絲延伸方向平行，跨越整個肌節(jié)，而obscurin與肌動蛋白絲垂直，主要集中于M線及新生肌節(jié)的Z盤水平。Obscurin出現(xiàn)后，輔肌動蛋白的分布也隨之發(fā)生變化，呈橫紋狀集中分布于Z盤水平[10-11]。Obscurin在A帶M線表達后，引導肌球蛋白組裝至A帶。利用病毒轉(zhuǎn)染使早期肌細胞過表達obscurin的C端，可導致A帶中的肌球蛋白量明顯減少，而肌間蛋白不受明顯影響[12]。通過利用病毒轉(zhuǎn)染小干擾RNA靶向干擾obscurin的第一個編碼外顯子，從而降低obscurin表達量，有研究者發(fā)現(xiàn)，雖然輔肌動蛋白仍能實現(xiàn)橫紋化分布，但肌纖維更容易出現(xiàn)分叉、零散、多分支現(xiàn)象，肌球蛋白彌漫分布，肌細胞無法有效收縮[13]。與此同時，obscurin與肌漿網(wǎng)特異的錨蛋白（Ank 1.5） 作用，引導肌漿網(wǎng)在Z盤水平的集中分布及肌節(jié)間縱向延伸。特異性敲除OBSCN基因的純合子小鼠心肌組織電鏡切片后，發(fā)現(xiàn)其縱向延伸至M線的肌漿網(wǎng)顯著減少[14]。

2017年，有報道提出，obscurin與肌細胞內(nèi)鈣循環(huán)的建立密切相關(guān)，并首次發(fā)現(xiàn)了obscurin突變與心肌細胞電活動異常的相關(guān)性[15]。OBSCN基因R4344Q突變在一肥厚型心肌病家系中被證明有致病性[16]。在特異性敲入該位點突變的純合子小鼠模型中觀察到，靜息狀態(tài)下1歲的小鼠心肌大體結(jié)構(gòu)無明顯變化，但心電監(jiān)護顯示突變小鼠的基礎(chǔ)心率更快，更容易出現(xiàn)自發(fā)室性心律失常。對鈣循環(huán)相關(guān)蛋白的檢測提示，肌漿網(wǎng)鈣泵2a表達量升高，而受磷蛋白（PLN）五聚體明顯下降，肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣儲量增加，從而引起鈣電流的不穩(wěn)定；其作用機制可能與突變結(jié)構(gòu)域Ig58與PLN作用增強有關(guān)；在長期不穩(wěn)定鈣電流刺激下，心室出現(xiàn)重構(gòu)，繼發(fā)心肌肥厚或心室擴大[15]。

此外，obscurin-A含有的RhoGEF結(jié)構(gòu)域被認為參與Ras同源基因家族成員A（RhoA）-Rho相關(guān)螺旋卷曲蛋白激酶1（ROCK1）/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（CRIK）信號通路的調(diào)控，從而介導心肌肥厚[17]。Obscurin將Ank 1.5聚集于M線水平抑制鉀離子通道四聚化結(jié)構(gòu)域-6蛋白（KCTD6）介導的錨蛋白降解[18]。體外動物實驗發(fā)現(xiàn)，位于心肌細胞閏盤中的obscurin小分子型過表達可引起心肌細胞連接松散、細胞體積縮小，可能與小分子型通過PH結(jié)構(gòu)域與細胞膜上的磷脂酰肌醇-4, 5-二磷酸（PIP2）結(jié)合，調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路的激活相關(guān)[7]。更多的obscurin分子型功能尚待進一步研究。

4 OBSCN基因突變及相關(guān)心肌病

目前明確，與OBSCN基因突變相關(guān)的疾病主要為遺傳性心肌病、肌病等。2007年，一名日本青年被發(fā)現(xiàn)攜帶R4344Q雜合突變并表現(xiàn)為肥厚型心肌病[16]。有研究人員利用全外顯子組測序技術(shù)，在74例中國散發(fā)性肥厚型心肌病患者中鑒定出6個全新的罕見OBSCN基因變異，均為雜合子致病，其中4個為靠近N端的移碼突變，2個為靠近C端的點突變，而在2 000例正常對照者中不存在上述變異，因此這些基因變異高度可疑致病，但具體致病機制尚不明確[19]。在一項對30例擴張型心肌病終末期患者心肌樣本進行全外顯子組測序的研究中，4個樣本檢測出OBSCN基因突變，其中3個考慮為可疑的致病突變，導致obscurin表達量明顯下降（為對照組的45%～72%），而正常對照、非OBSCN基因突變的擴張型心肌病及肥厚型心肌病患者之間的obscurin表達量無明顯差異，提示OBSCN基因突變可能通過單倍體不足的機制致病[20]。在左心室致密化不全、遠端肌萎縮等疾病中，也有少數(shù)OBSCN基因突變的報道。Rowland等[21]在10例左心室致密化不全患者中檢測到3個全新的OBSCN基因突變，包含2個移碼突變和1個剪接突變，突變位點均集中于obscurin-B特有的C末端。在一個法國家系中，同時攜帶OBSCN c. 13330C＞T和FLNC c.5161delG突變的患者表現(xiàn)為遠端肌萎縮，較此前保加利亞家系中報道過的FLNC c. 5160delC致病的外顯率更高，發(fā)病年齡更早，檢測發(fā)現(xiàn)患者體內(nèi)的突變型obscurin與肌聯(lián)蛋白的結(jié)合力下降約15倍，可能通過降低肌纖維的穩(wěn)定性而促進遠端肌萎縮的發(fā)病[22]。Forleo等[23]利用靶基因測序技術(shù)，在8例致心律失常性右心室心肌病患者中，檢測出其中2例有3個OBSCN基因變異，其中OBSCN c. 17371G＞C為可疑的致病突變，但缺乏進一步的功能驗證研究。此外，有臨床研究表明，攜帶OBSCN基因突變的乳腺癌患者在接受化療或靶向治療過程中更容易出現(xiàn)左心室射血分數(shù)下降甚至擴張型心肌病[24]，提示OBSCN基因的多態(tài)性在腫瘤心臟病學研究中亦是不可忽視的一部分?；熛嚓P(guān)的心臟毒性生物標志物，包括一些應用轉(zhuǎn)錄組學或代謝組學檢測到的標記分子，作為早期識別和診斷化療期間心臟毒性的重要手段，正逐漸被臨床認可和重視[25]。如果能從基因水平識別出化療相關(guān)心臟毒性的高危人群，就能預先針對性地調(diào)整化療方案和采取預防措施，達到精準醫(yī)療的目的。

5 小結(jié)

綜上所述，obscurin在心肌的發(fā)育及正常結(jié)構(gòu)功能的維持中發(fā)揮著重要的作用。關(guān)于obscurin的功能，仍有許多尚未明確的機制值得進一步深入研究，包括其不同分子型的表達調(diào)控及功能差異、對肌細胞電活動及細胞間連接穩(wěn)定性的影響等。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)許多不明原因的心肌病患者中存在多種多樣的OBSCN基因變異，但大多缺乏有關(guān)其致病性及致病機制的深入研究?；驒z測對于遺傳性心肌病的早期診斷、治療和預后的意義日益顯著，在探索疾病發(fā)病機制、危險分層和指導優(yōu)生優(yōu)育方面有不可替代的作用[26]，而由于OBSCN基因序列長，功能區(qū)復雜，可能存在許多并不具有致病性的單核苷酸多態(tài)性，需要進一步研究，以明確OBSCN基因變異與心肌病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，探究其可能的致病機制，尋找藥物治療、基因治療的靶點等。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突