黃清波

(淄博市第一醫(yī)院藥學(xué)部，山東 淄博 255200)

甲狀腺癌屬于內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)生可能與電離輻射、雌激素、遺傳、碘的不合理攝入等多種因素有關(guān)，總體發(fā)病率呈上升趨勢(shì)〔1〕。1974～2013年，美國(guó)甲狀腺癌發(fā)病率和死亡率平均每年分別增加3.6%和1.1%，根據(jù)人口統(tǒng)計(jì)等數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)，到2030年甲狀腺癌將成為美國(guó)第4大惡性腫瘤〔2，3〕。在甲狀腺癌的治療中，綜合手術(shù)、放療、化療等多模式治療提高了患者生存率，而放射敏感性的降低是限制放療效果的主要因素〔4〕。冬凌草具有活血止痛、抗菌消炎、清熱解毒等功效，可用于治療癌癥〔5〕。冬凌草甲素(Ori)是冬凌草抗腫瘤的主要活性成分，可從香茶菜、毛葉香茶菜等多種植物中提取，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬、凋亡等功能〔6，7〕。研究表明〔8～10〕，Ori可有效抑制人結(jié)腸癌、胃癌等多種腫瘤細(xì)胞增殖并調(diào)節(jié)細(xì)胞耐藥性，但其對(duì)癌細(xì)胞放射敏感性的研究較少。本文擬探討Ori對(duì)BCPAP細(xì)胞放射敏感性的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 胎牛血清(批號(hào)：SH41288)、RPMI1640培養(yǎng)液(批號(hào)：SH30807)購(gòu)自美國(guó)Gibco-BRL公司；噻唑藍(lán)(MTT，批號(hào)：M2129)、碘化丙啶(PI，批號(hào)：D4543)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Annexin V-異硫氰酸熒光素(FITC)凋亡檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：170207)購(gòu)自美國(guó)Coulter公司；二喹啉甲酸(BCA)試劑盒(批號(hào)：PC0020)、吉姆薩染色液(批號(hào)：G1015)、二甲基亞砜(DMSO，批號(hào)：D8370)購(gòu)自北京Solarbio公司；硝酸纖維素膜(批號(hào)：HATF00010)購(gòu)自Millipore公司；caspase-3(批號(hào)：20220)、caspase-9活性檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：20009)購(gòu)自美國(guó)R&D 公司；一抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗購(gòu)自武漢博海生物公司；MCO-18AC型CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自日本SANYO公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司；HBS-1096B型酶標(biāo)儀購(gòu)自南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及照射 使用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液于37℃、5% CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)Nthy-ori 3-1和BCPAP細(xì)胞。待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，胰酶消化收集，以5×103個(gè)/孔接種至96孔板，以Varian IX直線加速器6 MV X射線照射，劑量率3 Gy/min，源皮距100 cm。

1.3克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞存活分?jǐn)?shù) 取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的Nthy-ori 3-1和BCPAP細(xì)胞，消化離心收集，以適宜濃度接種于6孔板，分為Ori組和照射組。Ori組給予不同濃度(2.5、5.0、10.0、20.0、50.0 μmol/L)的Ori作用24 h，以等量DMSO處理為對(duì)照組；照射組細(xì)胞給予2.5、5.0、10.0 μmol/L Ori作用24 h后，以0、2、4、6、8 Gy X射線照射，繼續(xù)培養(yǎng)14 d。磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后4 % 多聚甲醛固定，吉姆薩液染色30 min，洗去染液，晾干后進(jìn)行克隆計(jì)數(shù)。每組3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，計(jì)算細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)。

1.4MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 取Nthy-ori 3-1和BCPAP細(xì)胞以5×103個(gè)/孔接種于96孔板，以含終濃度2.5、5.0、10.0、20.0、50.0 μmol/L Ori的RPMI1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)24 h，DMSO組為對(duì)照；收集BCPAP細(xì)胞接種至96孔板，分為DMSO(對(duì)照)組、Ori 5 μmol/L組(5 μmol/L Ori干預(yù))、IR組(4 Gy X射線照射)、Ori 5 μmol/L+IR組(5 μmol/L Ori干預(yù)聯(lián)合4 Gy X射線照射)、Ori 5 μmol/L+IR+丙二醇甲醚酯酸酯(PMA)組〔5 μmol/L Ori和100 μmol/L PMA干預(yù)聯(lián)合4 Gy X射線照射〕。以上各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h，加入20 μl MTT(5 mg/ml)，孵育4 h后吸除培養(yǎng)液，加入150 μl DMSO振蕩反應(yīng)10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處吸光度(A)值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 收集DMSO組、Ori 5 μmol/L組、IR組、Ori 5 μmol/L+IR組細(xì)胞，消化離心，PBS重懸細(xì)胞。以75%預(yù)冷無(wú)水乙醇4℃固定過(guò)夜，離心去上清，加入5 μl PI，室溫染色30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞周期。

1.6細(xì)胞凋亡檢測(cè) 收集DMSO組、Ori 5 μmol/L組、IR組、Ori 5 μmol/L+IR組細(xì)胞，PBS洗滌3次；按照Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書分別加入195 μl Annexin V-FITC結(jié)合液和5 μl Annexin V-FITC輕輕混勻，10 μl PI室溫避光孵育20 min，立即使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.7Western印跡法檢測(cè)P53、P21、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)1、B淋巴細(xì)胞瘤(Bcl)2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3、caspase-9、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)、磷酸化(p)-ERK蛋白表達(dá) 使用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液于冰上裂解細(xì)胞，4℃，3 000 r/min離心20 min，取上清，BCA試劑盒測(cè)定蛋白樣品濃度。取40 μg蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，含5%脫脂奶粉TBST液室溫封閉1 h；分別加入相應(yīng)的一抗(1∶1 000)4℃孵育過(guò)夜，洗膜后加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，洗滌，使用電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒顯示條帶，以β-actin為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1Ori抑制Nthy-ori 3-1和BCPAP細(xì)胞活力 克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Ori能降低Nthy-ori 3-1和BCPAP細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)，抑制細(xì)胞增殖，呈濃度依賴性，對(duì)比Nthy-ori 3-1細(xì)胞，Ori對(duì)BCPAP細(xì)胞活力的抑制作用更明顯(P<0.05)，見(jiàn)表1。MTT法檢測(cè)不同濃度Ori干預(yù)后細(xì)胞活力，發(fā)現(xiàn)2.5、5.0、10.0、20.0、50.0 μmol/L Ori能明顯抑制BCPAP細(xì)胞活力(P<0.05)，見(jiàn)表2。10.0、20.0、50.0 μmol/L Ori處理36 h、48 h顯著抑制Nthy-ori 3-1細(xì)胞活力(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表1 不同濃度Ori抑制Nthy-ori 3-1組 和BCPAP組細(xì)胞存活率比較

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與Nthy-ori 3-1組比較：2)P<0.05

表2 不同濃度Ori對(duì)BCPAP細(xì)胞吸光度值的影響

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；表3、7、8、11同

2.2Ori對(duì)BCPAP細(xì)胞的放射增敏作用 不同劑量X射線照射后對(duì)比對(duì)照組，Ori 2.5、5.0和10.0 μmol/L組BCPAP細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)明顯減小(P<0.05)；X射線照射劑量為2、4、6、8 Gy時(shí)，Ori 2.5、5.0和10.0 μmol/L組細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)較0 Gy顯著減小(P<0.05)，見(jiàn)表4。不同濃度Ori處理的Nthy-ori 3-1細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)各照射劑量無(wú)明顯變化(P>0.05)，見(jiàn)表5。Ori 5.0 μmol/L+IR組BCPAP細(xì)胞活力明顯低于Ori 5.0 μmol/L組和IR組(P<0.05)，而IR組細(xì)胞活力低于Ori 5.0 μmol/L組(P<0.05)，表明5.0 μmol/L Ori對(duì)BCPAP細(xì)胞具有放射增敏作用，見(jiàn)表6。

表3 不同濃度Ori處理不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)Nthy-ori -3-1細(xì)胞吸光度值的影響

表4 不同照射劑量對(duì)BCPAP細(xì)胞存活率比較

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與0 Gy比較：2)P<0.05

表5 不同照射劑量對(duì)Nthy-ori 3-1 細(xì)胞存活率影響

表6 處理不同時(shí)間點(diǎn)Ori抑制各組BCPAP細(xì)胞存活率比較

與Ori 5.0 μmol/L組比較:1)P<0.05；與IR組比較:2)P<0.05

2.3Ori聯(lián)合X射線照射對(duì)BCPAP細(xì)胞周期的影響 與對(duì)照組相比，Ori 5.0 μmol/L組細(xì)胞周期無(wú)明顯變化(P>0.05)，IR組和Ori 5.0 μmol/L+IR組細(xì)胞S期、G0/G1期比例明顯下降(P<0.05)；Ori 5.0 μmol/L+IR組細(xì)胞S期、G0/G1期比例下降幅度最大，見(jiàn)表7。

2.4Ori對(duì)BCPAP細(xì)胞p53、p21、CDKI蛋白表達(dá)的影響 對(duì)比對(duì)照組，Ori 5.0 μmol/L組、IR組、Ori 5.0 μmol/L+IR組細(xì)胞p53、p21蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，CDK1蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)，Ori 5.0 μmol/L+IR組細(xì)胞p53、p21、CDK1蛋白表達(dá)上調(diào)或下調(diào)幅度最大。見(jiàn)圖1、表8。

表7 Ori 聯(lián)合 X 射線照射對(duì) BCPAP 細(xì)胞周期值的影響

圖1 各組細(xì)胞p53、p21、CDK1蛋白表達(dá)

2.5Ori增加輻射照射對(duì)BCPAP細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用 對(duì)比對(duì)照組，Ori 5.0 μmol/L組、IR組、Ori 5.0 μmol/L+IR組BCPAP細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.05)，Ori 5.0 μmol/L+IR組細(xì)胞凋亡率顯著高于IR組和Ori 5.0 μmol/L組(P<0.05)，見(jiàn)圖2、表9。進(jìn)一步檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，Ori 5.0 μmol/L組、IR組、Ori 5.0 μmol/L+IR組細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)，Bax、caspase-3、caspase-9蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05);與IR組和Ori 5.0 μmol/L組比較，Ori 5.0 μmol/L+IR組Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9蛋白表達(dá)改變最明顯(P<0.05)，見(jiàn)圖3、表10。

表8 Ori 對(duì)BCPAP細(xì)胞p53、p21、CDKI蛋白表達(dá)的影響

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡

表9 不同照射時(shí)間點(diǎn)各組BCPAP細(xì)胞凋亡率比較

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與Ori 5.0 μmol/L、IR組比較：2)P<0.05；表10同

2.6Ori調(diào)控ERK-p53通路對(duì)BCPAP細(xì)胞的放射增敏作用 Ori 5.0 μmol/L+IR組BCPAP細(xì)胞活力較對(duì)照組明顯下降(P<0.05)，p-ERK蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)；Ori 5.0 μmol/L+IR+PMA組細(xì)胞活力顯著回升(P<0.05)，p-ERK蛋白表達(dá)顯著回升(P<0.05)；各組細(xì)胞中ERK蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化(P>0.05)，見(jiàn)圖4、表11。

表10 各組BCPAP凋亡細(xì)胞蛋白表達(dá)比較

圖4 各組細(xì)胞中ERK、p-ERK蛋白表達(dá)

表11 各組BCPAP細(xì)胞中ERK、P-ERK蛋白表達(dá)及細(xì)胞活力對(duì)比

3 討 論

Ori是從植物中提取出的二萜類化合物，能夠抑制細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)，阻滯細(xì)胞周期；通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)磷酯酰肌醇3激酶(PI3K)/絲氨酸激酶(Akt)信號(hào)通路和ERK通路誘導(dǎo)細(xì)胞自噬、凋亡；從而對(duì)腫瘤發(fā)揮抑制作用〔6，11〕。其抗腫瘤活性引起癌癥生物學(xué)家的廣泛關(guān)注，Li等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)，Ori能夠調(diào)節(jié)自噬相關(guān)蛋白beclin-1、LC3-Ⅱ和凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2表達(dá)，誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞凋亡。在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中，Ori可抑制表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)/ERK/基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-12和蛋白磷酸酶(PP)2A的癌性抑制因子(CIP2A)/PP2A/Akt信號(hào)通路，增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對(duì)吉非替尼的耐藥性；并且對(duì)食管癌細(xì)胞具有明顯的放射增敏作用〔13，14〕。在甲狀腺癌的研究中，10 μmol/L Ori干預(yù)可促進(jìn)BCPAP細(xì)胞中DNA修復(fù)酶(PARP)及p-ERK蛋白表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡〔15〕。細(xì)胞周期調(diào)控與細(xì)胞凋亡是研究癌癥發(fā)生發(fā)展機(jī)制的重要內(nèi)容，其中，p53介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑起重要作用。p53是一種人體腫瘤抑制基因，可與其下游細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制因子p21共同組成細(xì)胞周期檢查站，DNA損傷則細(xì)胞周期停滯〔16，17〕。CDK1是周期蛋白依賴性激酶家族的一員，p53激活p21基因轉(zhuǎn)錄后，p21與CDK1結(jié)合成復(fù)合物或干擾細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CAK)磷酸化，抑制CDK1活性，抑制周期蛋白表達(dá)，使細(xì)胞停滯在G2期〔18，19〕。bcl-2基因家族與細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)密切相關(guān)，其中Bcl-2和Bax分別在抑制凋亡和促進(jìn)凋亡起關(guān)鍵作用，Bcl-2/Bax比值直接決定細(xì)胞是否發(fā)生凋亡〔20〕。

ERK激活后磷酸化成為p-ERK，可將細(xì)胞信號(hào)從表面受體傳導(dǎo)至細(xì)胞核，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、分裂等多種生物過(guò)程〔21〕。ERK存在于細(xì)胞質(zhì)中，被激活后移位于細(xì)胞核，調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝和功能，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔22〕。研究表明〔23，24〕，調(diào)節(jié)ERK可增強(qiáng)鼻咽癌、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞放射敏感性。

綜上，Ori可通過(guò)阻滯BCPAP細(xì)胞周期，調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，調(diào)控ERK通路增強(qiáng)細(xì)胞放射敏感性。這一研究有助于進(jìn)一步了解甲狀腺癌發(fā)病機(jī)制，為甲狀腺癌的臨床治療提供新靶點(diǎn)。