余秀 易琳琳 王悅

(內(nèi)江市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川 內(nèi)江 641000)

血管性癡呆(VD)被認(rèn)為是繼阿爾茨海默病之后最常見(jiàn)的癡呆類型〔1，2〕。據(jù)預(yù)測(cè)，到2040年全球癡呆病人將達(dá)到8 110萬(wàn)例，其中中國(guó)癡呆病人將是所有發(fā)達(dá)國(guó)家癡呆病人的總和〔3〕。包括肌醇酶(IRE)1-c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號(hào)通路介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在內(nèi)的氧化應(yīng)激被認(rèn)為在VD發(fā)病機(jī)制中起重要作用〔4〕。硫氧還蛋白(Trx)-1是一種重要的二硫化還原酶，在控制細(xì)胞氧化還原狀態(tài)中起重要作用〔5〕。本實(shí)驗(yàn)研究Trx-1過(guò)表達(dá)對(duì)VD模型大鼠海馬組織神經(jīng)損傷的保護(hù)及認(rèn)知能力的改善作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 50只6～7周齡SPF級(jí)健康雄性SD大鼠，體重(260±20)g，購(gòu)自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司。動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(湘)2014-0010。HEK293T人胚腎上皮細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)。Trx-1重組慢病毒質(zhì)粒pLV-EF1a-EGFP(2A)-Puro-Trx-1及包裝質(zhì)粒PH1、PH2由北京英茂盛業(yè)生物科技有限公司設(shè)計(jì)并構(gòu)建；LipofectamineTM2000購(gòu)自Invitrogen公司；DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；青霉素、鏈霉素購(gòu)自上海拜力生物科技有限公司；IRE1靶向抑制劑KIRA6購(gòu)自美國(guó)MedChemExpress公司；全蛋白提取、二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量測(cè)定試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒、原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；超敏電化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所；兔抗人Trx-1多克隆抗體、兔抗人磷酸化IRE1〔p-IRE1(S724)〕多克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；小鼠抗人磷酸化JNK〔p-JNK(Thr183/Tyr185)〕單克隆抗體、兔抗人GAPDH單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠免疫球蛋白(Ig)G和HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。Morris水迷宮購(gòu)自北京智鼠多寶生物科技有限責(zé)任公司產(chǎn)品；光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司產(chǎn)品；HHQ-2158輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)購(gòu)自杭州艾普儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；Tanon-4100全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像儀購(gòu)自上海天能科技有限公司產(chǎn)品。

1.2HEK293T細(xì)胞的培養(yǎng)及Trx-1重組慢病毒的制備 將HEK293T細(xì)胞置于含有100 ml/l FBS、100 IU/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的DMEM中，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEK293T細(xì)胞，提前2 d接種于培養(yǎng)皿中。更換新鮮培養(yǎng)基，取5 μg Trx-1重組慢病毒質(zhì)粒pLV-EF1a-EGFP(2A)-Puro-Trx-1、3.75 μg輔助質(zhì)粒PH1和1.25 μg PH2質(zhì)粒與相應(yīng)體積的Opti-MEM混合均勻，總體積為2.5 ml，于室溫下孵育5 min，以空載重組質(zhì)粒作陰性對(duì)照。取100 μl LipofectamineTM2000與2.4 ml Opti-MEM混合，室溫孵育5 min。再將兩種Opti-MEM混合液混合形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染72 h后，收集細(xì)胞上清液，離心、過(guò)濾。上清液于4℃、25 000 r/min離心2 h，所獲病毒分別命名為L(zhǎng)v-Trx-1〔病毒滴度：1.1×108轉(zhuǎn)導(dǎo)單位(TU)/ml〕和Lv-NC(病毒滴度：0.9×108TU/ml)，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉再通法構(gòu)建VD大鼠模型 參照王蕊等〔6,7〕推薦的方法進(jìn)行造模。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，采用2%的戊巴比妥鈉(3 ml/kg)腹腔注射麻醉，后仰臥位將大鼠固定于手術(shù)臺(tái)上，頸部皮膚剪毛暴皮，常規(guī)消毒處理；采用手術(shù)刀于頸正中切口，鈍性分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，隨機(jī)用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈，夾閉10 min再通10 min，重復(fù)一次；后在手術(shù)切口處施以適量青霉素消毒并縫合傷口，放回籠中日常飼養(yǎng)。

1.4動(dòng)物分組及干預(yù) 按體重將SD大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組(Sham組)、模型組(VD組)、Trx-1過(guò)表達(dá)空載慢病毒干預(yù)組(VD/Lv-NC組)、Trx-1過(guò)表達(dá)慢病毒干預(yù)(VD/Lv-Trx-1組)及肌醇酶(IRE)1抑制劑KIRA6干預(yù)組(VD/KIRA6組)各10只。各干預(yù)組及模型組建立VD模型。VD/Lv-NC及VD/Lv-Trx-1組在造模前24 h側(cè)腦注射對(duì)應(yīng)慢病毒溶液0.2 ml；VD/KIRA6組在造模前2 h側(cè)腦注射KIRA6溶液(劑量10 mg/kg)；Sham及VD組則注射等量生理鹽水。

1.5Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)知能力〔8〕造模24 h 后，參照參考文獻(xiàn)對(duì)各組進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)知能力。其中定位航行實(shí)驗(yàn)主要記錄實(shí)際逃避潛伏期；而后續(xù)的空間探索實(shí)驗(yàn)則記錄120 s內(nèi)跨越原平臺(tái)的次數(shù)。

1.6蘇木素-伊紅(HE)染色觀察腦組織海馬區(qū)病理變化〔9〕水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，斷頭處死各組并取腦組織，區(qū)視交叉后至小腦前部分，作兩道垂直切口，剝離海馬區(qū)，并分成兩等份。一部分保存于4%多聚甲醛固定48 h，另一部分-80℃凍存?zhèn)溆?。取固?8 h的海馬區(qū)標(biāo)本，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋制作病理切片(厚度3～5 μmol/L)。將石蠟切片依次再經(jīng)脫蠟、HE染色、分化及藍(lán)化后HE染色、洗滌脫水及透明后封片。光鏡下觀察染色并采集圖片。

1.7TUNEL染色檢測(cè)海馬區(qū)細(xì)胞凋亡〔10〕將海馬區(qū)石蠟切片依次進(jìn)行TUNEL染色處理：烤片和脫蠟；水化；蛋白酶K工作液常溫孵育15～30 min；滴加50 μl TUNEL反應(yīng)混合液于樣品上，在濕盒、暗室中37℃避光孵育60 min；用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次；加入50 μl轉(zhuǎn)化劑POD于樣品上，在濕盒中37℃避光孵育30 min；用PBS沖洗3次；加入100 μl DAB底物，于15～25℃孵育10 min；用PBS沖洗3次；HE復(fù)染、脫水、透明；封片，光鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，陽(yáng)性染色的細(xì)胞核成棕褐色，即凋亡細(xì)胞，凋亡率以高倍鏡下計(jì)數(shù)1 000個(gè)細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞百分比表示。

1.8Western印跡檢測(cè)蛋白表達(dá)〔11〕取-80℃凍存的海馬組織，分別進(jìn)行蛋白提取后進(jìn)行濃度檢測(cè)；取20 μg蛋白和4 μl 2×十二烷基硫酸鈉(SDS)上樣緩沖液混合均勻，100℃變性10 min；上樣，10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離后轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上；用5%脫脂牛奶封閉1 h；PBS洗膜；PBS洗膜后分別加入一抗在4℃下，孵育過(guò)夜；PBS洗膜；加入HRP標(biāo)記的二抗IgG室溫孵育0.5 h；PBS洗膜；用電化學(xué)發(fā)光進(jìn)行顯色。以GAPDH為內(nèi)參蛋白，后采用Quantity One圖像處理軟件對(duì)各指標(biāo)灰度值進(jìn)行半定量分析。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、Tukey檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組認(rèn)知能力比較 與Sham組比較，VD組逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)、跨越原平臺(tái)次數(shù)顯著減少(P<0.01)；與VD組比較，VD/Lv-Trx-1組及VD/KIRA6組逃避潛伏期顯著縮短、跨越原平臺(tái)次數(shù)顯著增多(P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1 各組Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

與Sham組比較:1)P<0.01;與VD組比較:2)P<0.01；下表同

2.2各組海馬區(qū)病理改變比較 Sham組腦組織海馬區(qū)錐體細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，輪廓清晰可見(jiàn)，排列整齊，細(xì)胞數(shù)目多，核仁明顯，胞質(zhì)豐富；VD組與VD/Lv-NC組腦組織海馬區(qū)病理改變類似，錐體細(xì)胞排列雜亂，基質(zhì)疏松，細(xì)胞脫失顯著，部分細(xì)胞出現(xiàn)核固縮、溶解等現(xiàn)象；而VD/Lv Trx-1組及VD/KIRA6組海馬區(qū)病變稍輕微，僅少量錐體細(xì)胞變性、脫失或核固縮，錐體細(xì)胞排列較整齊，核仁較清晰，見(jiàn)圖1。

圖1 各組海馬區(qū)病理學(xué)變化(HE，×200)

2.3各組海馬區(qū)細(xì)胞凋亡情況比較 與Sham組〔(5.01±0.24)%〕比較，VD組〔(25.41±2.36)%〕差異顯著升高(P<0.01)；與VD組比較，VD/Lv-Trx-1組〔(10.15±1.24)%〕和VD/KIRA6組〔(9.48±0.89)%〕均顯著降低(P<0.01)。VD/Lv-NC組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率為〔(22.78±1.87)%〕。

2.4各組海馬區(qū)Trx-1、p-IER1和p-JNK蛋白相對(duì)表達(dá)水平 與Sham組比較，VD組Trx-1蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)，p-IRE1和p-JNK水平顯著升高(均P<0.01)。與VD組比較，VD/Lv-Trx-1組和VD/KIRA6組Trx-1蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)，p-IRE1和p-JNK水平顯著降低(均P<0.01)，見(jiàn)表2。

表2 各組海馬區(qū)Trx-1、p-IER1和p-JNK蛋白相對(duì)表達(dá)水平

3 討 論

研究顯示，缺血性神經(jīng)元損傷發(fā)生的同時(shí)，Trx-1的表達(dá)會(huì)發(fā)生明顯變化。在大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)模型中發(fā)現(xiàn)，Trx-1的表達(dá)及免疫活性降低〔12〕。而Trx-1過(guò)表達(dá)明顯改善缺血再灌注所致的神經(jīng)元損傷〔13〕。相反，Trx-1-siRNA對(duì)于缺血再灌注的干預(yù)則增加了模型動(dòng)物神經(jīng)功能缺損、腦梗死和腦積水〔14〕。因此猜測(cè)過(guò)表達(dá)Trx-1同樣能改善VD模型大鼠的認(rèn)知能力和神經(jīng)損傷。

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)是目前世界上公認(rèn)的較為客觀的認(rèn)知能力評(píng)價(jià)方法。本研究提示Trx-1過(guò)表達(dá)與IRE1抑制劑KIRA6均能改善VD大鼠的認(rèn)知能力，對(duì)VD起一定的治療作用。HE染色結(jié)果同樣也說(shuō)明了這一點(diǎn)。

細(xì)胞凋亡是一種重要的生命現(xiàn)象，不僅出現(xiàn)在生理狀態(tài)下，更與包括VD在內(nèi)的多種疾病發(fā)生密切相關(guān)〔15〕。而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可啟動(dòng)細(xì)胞凋亡，這是近年才發(fā)現(xiàn)的一條新的細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路〔16〕。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)早期，IRE1被激活并具有核酸內(nèi)切酶活性，引導(dǎo)蛋白正確折疊，使細(xì)胞恢復(fù)正常狀態(tài)；但如果應(yīng)激繼續(xù)加重，IRE1就會(huì)激活JNK激酶誘發(fā)細(xì)胞凋亡〔17〕。在本研究中發(fā)現(xiàn)，Trx-1過(guò)表達(dá)顯著抑制了VD大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，且IRE1抑制劑KIRA6干預(yù)同樣抑制了海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡；此外，免疫印跡檢測(cè)結(jié)果顯示Trx-1過(guò)表達(dá)與IRE1抑制劑KIRA6均能顯著抑制VD大鼠IRE1-JNK信號(hào)通路的激活。綜上，慢病毒介導(dǎo)的Trx-1過(guò)表達(dá)能顯著保護(hù)VD大鼠的神經(jīng)損傷、改善認(rèn)知功能障礙，且這一效應(yīng)可能與抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)信號(hào)通路IRE1-JNK的活化有關(guān)。