鄭文龍 孟新顏 鄒亞君 王朝迅 常東

(1上海市浦東醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 201399；2徐州市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科；上海市浦東醫(yī)院 3老年醫(yī)學(xué)科；4內(nèi)分泌科)

2型糖尿病(T2DM)可引發(fā)全身各系統(tǒng)慢性損傷和功能障礙，好發(fā)于老年人群，而糖尿病(DM)周圍神經(jīng)病變(DPN)是最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，可影響局部神經(jīng)的正常生理功能，引發(fā)一系列臨床綜合征，目前發(fā)病機(jī)制仍未明確〔1〕。相關(guān)研究顯示，DM發(fā)病和DPN與體內(nèi)異常炎癥狀態(tài)有關(guān)〔2〕。單核細(xì)胞Toll樣受體(TLRs)激活后可通過(guò)髓樣分化蛋白(MyD88)信號(hào)通路分泌大量炎性因子，誘發(fā)體內(nèi)免疫炎癥反應(yīng)，TLR4是TLRs家族介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的主要受體〔3〕。陷窩蛋白-1是質(zhì)膜微囊標(biāo)志蛋白，可調(diào)控體內(nèi)免疫炎癥反應(yīng)〔4〕。本研究分析DPN患者外周血單核細(xì)胞中TLR4、MyD88表達(dá)情況，探討與神經(jīng)病變的關(guān)系及作用機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 收集2016年1月至2018年3月間上海市浦東區(qū)院收治的T2DM老年患者(年齡>45歲)210例，其中無(wú)神經(jīng)病變(TDM組)120例，伴周圍神經(jīng)病變(DPN組)90例。入選患者均依據(jù)世界衛(wèi)生組織DM診斷和分型標(biāo)準(zhǔn)確診為T2DM；DPN組患者經(jīng)神經(jīng)電生理檢查證實(shí)神經(jīng)纖維傳導(dǎo)減慢，且肢體末端存在麻木、痛覺(jué)過(guò)敏等癥狀。排除合并心、肝等重要器官功能障礙；入院前1個(gè)月內(nèi)有感染性疾病或炎性病變史的患者。選取同年齡段健康志愿者100名為對(duì)照組。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，受試者均簽署知情同意書(shū)。

1.2主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)于上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司；Trizol試劑、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、白細(xì)胞介素(IL)-6及腫瘤壞死因子(TNF)-α酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒均購(gòu)于廣州國(guó)奧生物技術(shù)有限公司；鼠抗人TLR4、陷窩蛋白-1、MyD88、IκB、p-IκB、β-actin單克隆抗體，山羊抗小鼠二抗辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記購(gòu)于北京百奧萊博科技有限公司。

1.3生化指標(biāo)檢測(cè) 抽取受試者晨起空腹肘靜脈血10 ml，取其中4 ml用于檢測(cè)生化指標(biāo)，全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定空腹血糖和血脂指標(biāo)〔三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)〕；血紅蛋白測(cè)定儀檢測(cè)糖化血紅蛋白(HbA1c)，散射比濁法檢測(cè)C反應(yīng)蛋白(CRP)。

1.4單核細(xì)胞分離和促炎因子檢測(cè) 取另外6 ml外周靜脈血，4 000 r/min分離血細(xì)胞和血漿，收集血細(xì)胞并加入淋巴細(xì)胞分離液，獲取單核細(xì)胞，洗滌后加入含10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基，細(xì)胞濃度調(diào)至1×106/L，接種于6孔板中，放入37℃ 5%CO2濃度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，孵育3 h，收集貼壁的單核細(xì)胞。血漿用于檢測(cè)促炎因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)，操作嚴(yán)格按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5TLR4、陷窩蛋白-1 mRNA檢測(cè) RT-PCR法進(jìn)行檢測(cè)，Trizol提取單核細(xì)胞中總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，TLR4、陷窩蛋白-1、β-actin引物合成由上海權(quán)陽(yáng)生物科技有限公司公司完成，TLR4引物序列：上游：5′-CACTCTCCTTCACTTTCGCC-3′，下游：5′-CACTCCTA CTACGGTCCTAC-3′；陷窩蛋白-1引物序列：上游：5′-CTTGTGTTACAACTCG GTG-3′，下游：5′-GGAAACGGGTCTTTCTTCT-3′；β-actin引物序列：上游：5′-GTTTCCACCTCCTCACCCAC-3′，下游：5′-GATGTCGTTGTCCCAC CACC-3′。總反應(yīng)體系30 μl，反應(yīng)條件：94℃ 10 min，94℃ 5 min，56℃ 50 s，72℃ 1 min，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，掃描得到目標(biāo)條帶灰度值，計(jì)算TLR4、陷窩蛋白-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.6TLR4、陷窩蛋白-1及下游信號(hào)蛋白檢測(cè) Western印跡法進(jìn)行檢測(cè)，外周血單核細(xì)胞中加入全蛋白提取液，離心取上清，BCA法蛋白定量，取目標(biāo)蛋白加入適量緩沖液，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜到聚偏氧乙烯(PVDF)，5%脫脂奶粉封閉2 h后分別滴加鼠抗人TLR4單克隆抗體(1∶200)、鼠抗人陷窩蛋白-1單克隆抗體(1∶500)、鼠抗人MyD88單克隆抗體(1∶200)、鼠抗人IκB單克隆抗體(1∶200)、鼠抗人p-IκB單克隆抗體(1∶200)、鼠抗人β-actin單克隆抗體(1∶1 000)；4℃冷藏過(guò)夜，滴加HRP標(biāo)記的小鼠抗人IgG(1∶1 000)，室溫孵育2 h，電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色，暗室中顯影、采集圖像，分析各條帶灰度值。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)及Spearman分析。

2 結(jié) 果

2.13組一般資料和生化指標(biāo)比較 與對(duì)照組相比，TDM組和DPN組HbA1c、CRP明顯升高，其中DPN組升高程度更明顯(P<0.05)；3組性別、年齡、BMI、DM病程、TG、TC、LDL-C、HDL-C差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 3組受試者一般資料和生化指標(biāo)比較

與對(duì)照組相比：1)P<0.05；與TDM組相比：2)P<0.05，下表同

2.23組血漿促炎因子濃度比較 3組血漿IL-1β、IL-6、TNF-α濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中TDM組、DPN組血漿IL-1β、IL-6、TNF-α濃度明顯高于對(duì)照組，DPN組患者血漿IL-1β、IL-6、TNF-α濃度明顯高于TDM組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 3組血漿促炎因子濃度比較

2.33組TLR4、陷窩蛋白-1 mRNA表達(dá)水平比較 TDM組、DPN組患LR4、陷窩蛋白-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，TDM組TLR4 mRNA相對(duì)表達(dá)明顯低于DPN組，陷窩蛋白-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于DPN組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 3組TLR4、陷窩蛋白-1 mRNA表達(dá)水平

2.4相關(guān)性分析 DPN患者外周血單核細(xì)胞中TLR4 mRNA表達(dá)與血漿IL-1β、IL-6、TNF-α呈顯著正相關(guān)(r=0.597、0.831，均P<0.05)；TLR4 mRNA表達(dá)與陷窩蛋白-1 mRNA呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.891，P<0.05)。

2.5各組TLR4、陷窩蛋白-1及下游信號(hào)蛋白表達(dá)水平比較 TDM組、DPN組外周血單核細(xì)胞中陷窩蛋白-1、IκB蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于對(duì)照組，TLR4、MyD88、p-IκB蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。與TDM組相比，DPN組陷窩蛋白-1、IκB蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯減少，TLR4、MyD88、p-IκB蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯增加(P<0.05)。見(jiàn)表4，圖1。

表4 3組外周血單核細(xì)胞中TLR4、陷窩蛋白-1及下游信號(hào)蛋白表達(dá)水平比較

與對(duì)照組相比：1)P<0.05；與TDM組相比：2)P<0.05

圖1 各組TLR4、陷窩蛋白-1及下游信號(hào)蛋白Western印跡電泳條帶

3 討 論

免疫炎癥是DPN發(fā)病機(jī)制的重要組成部分〔5〕。炎性因子TNF-α異常表達(dá)可通過(guò)一氧化氮合酶(NOS)、糖醛還原酶等多個(gè)途徑參與免疫炎癥反應(yīng)〔6〕。本研究結(jié)果提示干預(yù)病變患者體內(nèi)炎性因子水平的異常增加，有助于控制病情發(fā)展。TLRs為模式識(shí)別受體，激活后可經(jīng)下游信號(hào)蛋白MyD88相關(guān)信號(hào)通路分泌大量炎性因子，引發(fā)體內(nèi)大范圍的免疫炎癥反應(yīng)〔7〕。TLR4為TLRs介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的主要活性受體，研究者發(fā)現(xiàn)，T2DM和并發(fā)腎病患者的外周血單核細(xì)胞均存在前炎癥特征，表面TLR4表達(dá)水平顯著提升〔8〕。臨床研究顯示，TLR4基因多態(tài)性與1型DM患者DPN無(wú)明顯關(guān)聯(lián)，與T2DM患者明顯相關(guān)〔9〕。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，TLR4、TLR3在T2DM大鼠模型中的異常表達(dá)，可促進(jìn)炎性因子合成和分泌，參與周圍神經(jīng)病變進(jìn)程〔10〕。亦有研究顯示，通過(guò)輔酶Q10下調(diào)TLR4表達(dá)可明顯緩解DM大鼠的DPN變性疼痛〔11〕。

活化的TLR4可經(jīng)MyD88信號(hào)通路促進(jìn)下游信號(hào)蛋白IκB磷酸化，進(jìn)而誘發(fā)核轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核，合成并釋放大量炎性因子〔12〕。目前關(guān)于TLR4、MyD88信號(hào)通路與DPN關(guān)系的研究較少。且LR4、MyD88信號(hào)通路與DPN關(guān)系的研究多源于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。本研究結(jié)果提示TLR4、MyD88信號(hào)通路參與調(diào)控的外周免疫反應(yīng)與DPN患者體內(nèi)炎癥狀態(tài)相關(guān)。本研究相關(guān)性分析說(shuō)明血漿IL-1β、IL-6濃度升高在受活化的TLR4誘導(dǎo)合成之外可能還有其他調(diào)控途徑，TNF-α在TLR4介導(dǎo)的DPN中作用更明顯。T2DM外周血單核細(xì)胞中TLR4表達(dá)上調(diào)與多種因素明顯相關(guān)，相關(guān)研究顯示，體內(nèi)血糖水平及高血糖持續(xù)時(shí)間可能參與了TLR4異常表達(dá)〔13〕。HbA1c可較為準(zhǔn)確地反映近3個(gè)月的血糖控制水平〔14〕。

陷窩蛋白-1屬于細(xì)胞質(zhì)骨架蛋白，廣泛表達(dá)于人內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，能夠通過(guò)與相關(guān)受體直接接觸來(lái)調(diào)控其下游信號(hào)傳導(dǎo)，是胞外刺激進(jìn)入胞內(nèi)的最初環(huán)節(jié)，其表達(dá)異常與動(dòng)脈硬化、DM等明顯相關(guān)〔15〕。研究者發(fā)現(xiàn)，肥胖大鼠脂肪細(xì)胞中陷窩蛋白-1表達(dá)水平較正常大鼠明顯下降〔16〕；初診的T2DM患者單核細(xì)胞中陷窩蛋白-1蛋白和mRNA表達(dá)水平明顯低于健康人群，且HbA1c是陷窩蛋白-1表達(dá)的獨(dú)立影響因素〔17〕?；A(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，陷窩蛋白-1可抑制大鼠單核巨噬細(xì)胞活性，下調(diào)趨化因子和炎性介質(zhì)水平，發(fā)揮抗炎作用；敲除陷窩蛋白-1基因的大鼠體內(nèi)免疫系統(tǒng)受損，血清炎癥因子水平增加〔18〕。本研究結(jié)果提示陷窩蛋白-1表達(dá)下調(diào)可能加劇TLR4、MyD88信號(hào)通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，提升DPN患者體內(nèi)炎性因子和趨化因子的分泌量。