徐佳楠，楊 帥，倪永培，項興本，王少磊，韓興林，4，皇甫潔，4，王德良，4

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.安徽迎駕貢酒股份有限公司，安徽六安 231300；3.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京 100015；4.科技部國家酒類品質(zhì)與安全國際聯(lián)合研究中心，北京 100015）

長期以來，人們在飲用白酒時，往往會更加關(guān)注白酒飲用過程的感受，即由口感和風(fēng)味質(zhì)量所帶來的舒適感，在此方面所做相關(guān)研究也相對較多。但關(guān)于白酒飲用的舒適度，雖然也是飲酒感受的一部分，卻較少受到人們的關(guān)注。目前，白酒已然成為餐桌上助興、消愁解悶的必備品，人們對其品質(zhì)的要求隨著社會發(fā)展也有所提高[1]。白酒飲后舒適度是白酒品質(zhì)非常重要的體現(xiàn)，是區(qū)分優(yōu)質(zhì)白酒和普通白酒的重要方面，越來越多的白酒生產(chǎn)企業(yè)開始關(guān)注，尤其是酒類消費市場已經(jīng)由飲酒到舒適飲酒進(jìn)行深度轉(zhuǎn)變。

白酒特有的風(fēng)味主要源自酒體里面的微量物質(zhì)[2]，這些微量成分不但構(gòu)成了種類繁多、風(fēng)格各異的白酒[3-4]，還對酒精代謝、飲后行為及飲后舒適度起重要的影響作用。酒精在進(jìn)入人體后，會被迅速吸收，聚集于血液和各組織中，尤其是腦組織，僅有極少量酒精能夠直接排出體外，大部分仍然需要通過肝臟代謝[5]。由于酒精作為一種非特異性的中樞神經(jīng)抑制劑，會造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮和抑制，從而使得飲酒者的行為發(fā)生改變。少量的酒精能夠使飲酒者產(chǎn)生愉悅感，思維更加敏捷，但隨著酒精攝入量的增大，飲酒者行動力會減弱，且自控力下降，若是在攝入大量酒精下，則會喪失行動力，且意志模糊，甚至引起昏迷[6]。

目前，利用模式動物模型作為人體替代品評價酒精的研究，主要集中在醉酒、上頭、成癮、健康四個方面。動物精細(xì)行為學(xué)是試驗動物在精確控制前提下模型解析人在外界環(huán)境及刺激下的行為及產(chǎn)生原因的試驗系統(tǒng)。在很多場景下不但能模擬人情緒、運(yùn)動、活動等各方面特點，而且實驗結(jié)果具有較高的重復(fù)性，是目前國際上通行的試驗方法。

安徽迎駕貢酒作為濃香型白酒的代表之一，具有悠久的歷史文化底蘊(yùn)，是中國生態(tài)釀酒的倡導(dǎo)者與引領(lǐng)者。迎駕貢酒以優(yōu)質(zhì)高粱、大米、小麥等為原料，偏高溫大曲為糖化發(fā)酵劑[7]，以東淠河水釀造出芳香濃郁、綿柔甘洌、香味協(xié)調(diào)、入口甜、落口綿、尾凈余長的蒸餾酒。其獨特的原料配方和傳統(tǒng)釀造工藝，以及泥池老窖長周期發(fā)酵，使得“窖香優(yōu)雅，綿甜爽口”成為迎駕貢酒的典型風(fēng)格。本實驗通過對飲酒后小鼠自主行為變化以及酒精代謝程度的比較研究，對迎駕貢酒不同產(chǎn)品及其他濃香型白酒產(chǎn)品的飲后舒適度進(jìn)行評價，同時結(jié)合酒體風(fēng)味成分的主成分PCA分析，對酒樣在飲后行為及酒精代謝中起關(guān)鍵作用的酒體風(fēng)味成分初步研究確定，以期為迎駕貢酒產(chǎn)品品質(zhì)提高提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 酒樣

實驗組酒樣：酒樣A、酒樣B分別為迎駕貢酒的兩款濃香型白酒產(chǎn)品，酒樣C、酒樣D分別為當(dāng)?shù)厥惺鄣膬煽顫庀阈桶拙疲鶠槭惺?，實驗時將其酒精度數(shù)均調(diào)整為40%vol。

對照組樣品：對照組分為食用酒精對照組E和生理鹽水對照組F。食用酒精對照組的酒精度數(shù)調(diào)整為40%vol。

1.2 實驗動物

實驗動物：C57BL/6J小鼠，雄性，清潔Ⅱ級，鼠齡63 d，平均體重為30 g，購自北京維通利華實驗動物有限公司。實驗前1周將60只小鼠于室溫（23±2）℃，光照（150 lx）12 h和黑暗12 h環(huán)境中，自由飲水進(jìn)食飼喂。實驗前提前1 d將小鼠置于曠場實驗室以適應(yīng)環(huán)境；實驗時，將小鼠以每組10只隨機(jī)分為實驗組（酒樣A、酒樣B、酒樣C、酒樣D組）、食用酒精對照組和生理鹽水對照組。

1.3 儀器設(shè)備

Aoutosystem XL氣相色譜儀及TurboMatrix 40自動頂空進(jìn)樣器，購自Perkin Elmer。

曠場實驗動物行為學(xué)跟蹤系統(tǒng)：ANY-Maze系統(tǒng)（美國Stoelting公司），曠場為一個半徑為50 cm的透明有機(jī)玻璃圓筒，頂部裝有與系統(tǒng)連接的高頻攝像機(jī)用來跟蹤小鼠在曠場中的活動軌跡，精細(xì)行為參數(shù)由ANY-Maze軟件自動記錄。

1.4 曠場實驗方法

每組小鼠對應(yīng)一種實驗酒樣或?qū)φ諛悠饭辔噶烤鶠?.60 mL。

將每組小鼠依次在灌酒前0 h、灌酒后1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、24 h分別置于曠場實驗動物行為學(xué)跟蹤系統(tǒng)中，實時記錄與同步分析上述7個時刻小鼠自由運(yùn)動90 s的行為參數(shù)。實驗操作過程中保持安靜，每只動物實驗結(jié)束后及時清理糞便，減少之前動物的氣味，防止行為干擾。

1.5 小鼠血漿中乙醇和乙醛含量測定

分別于灌胃后第3 h、24 h時刻，采用斷尾取血采集小鼠血液標(biāo)本0.3 mL，加入30 μL肝素鈉（1800 U/mg），混勻后于離心機(jī)中3500 r/min離心10 min，取上清液，即為血漿，于-80 ℃進(jìn)行貯存，待測其中乙醇和乙醛含量。

測定方法依據(jù)《血液酒精含量的檢驗方法GA/T 842—2009》進(jìn)行改進(jìn)。頂空氣相色譜進(jìn)樣前將待測血漿進(jìn)行20倍稀釋，取稀釋樣品1 mL置于頂空瓶中，密封。色譜條件為：PE Aoutosystem XL型頂空氣相色譜儀，PE TurboMatrix 40自動頂空進(jìn)樣器。色譜柱：Agilent J&W-GC型30 m×0.53 mm×1.00 m硅烷化玻璃柱。溫度：檢測器250 ℃，進(jìn)樣口240 ℃，柱溫起始溫度40 ℃，以10 ℃/min升到60 ℃，保持0 min，再以20 ℃/min升到120 ℃，保持0 min，再以40 ℃/min升到215 ℃，頂空55 ℃，加熱時間40 min，載氣為N2、H2和空氣的流速分別設(shè)置為30 mL/min、45 mL/min、450 mL/min，F(xiàn)ID耦合火焰離子化檢測器，進(jìn)樣量：1 μL，進(jìn)樣時間9.38 min；乙醇出峰時間為3.39 min/L，乙醛出峰時間為1.35 min/L。

1.6 數(shù)據(jù)分析

實驗結(jié)果采用SPSS Statistics 23軟件，使用單因素ANOVA方法進(jìn)行統(tǒng)計，并使用OriginPro 2018作圖，數(shù)據(jù)使用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤表示；同時利用SPSS Statistics 23軟件，使用其中的降維功能，分別使用數(shù)值變量對應(yīng)分析方法和主成分PCA分析方法進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 小鼠飲酒后的自主行為活動分析

常見的動物行為實驗方法有曠場實驗、迷宮實驗、強(qiáng)迫游泳實驗等。曠場實驗（Open Field Test,OFT）是用來檢測小鼠自發(fā)活動行為（Locomotor Activity）和探索行為（Exploratory Behavior）的經(jīng)典動物行為學(xué)實驗[8]。由于小鼠具有畏懼空曠場地和活動的趨避性[9-10]，且會對新環(huán)境產(chǎn)生好奇心進(jìn)行探索[11]。所以常用圓形或方形的箱子做曠場，小鼠可以自由活動，箱子頂部配有攝像機(jī)以記錄小鼠活動[12-13]?，F(xiàn)階段，曠場實驗常應(yīng)用于藥物副作用的檢測，是一種廣泛使用的檢查藥物和焦慮行為影響的方法[14-15]。

對小鼠灌酒后1 h在礦場中自由運(yùn)動90 s的行為參數(shù)行動距離數(shù)據(jù)分析（圖1），結(jié)果表明，相對于其他實驗酒樣組與食用酒精組，迎駕貢酒B飲后的小鼠行動距離顯著增加（P＜0.05），迎駕貢酒A與其他濃香型白酒飲后小鼠的行動距離略低于食用酒精組，但是差異不顯著（P＞0.05）。

圖1 各組小鼠灌酒后1 h在曠場中運(yùn)動90 s的行為學(xué)指標(biāo)（行動距離）

行為參數(shù)比是灌酒后t時刻時90 s內(nèi)行為參數(shù)與灌酒前90 s行為參數(shù)的比值，用于評價和判定小鼠飲酒后的自主行為變化程度。通過行為參數(shù)比分析，可以降低小鼠因個體差異造成的實驗誤差。本實驗中選用的行為參數(shù)比為行動距離比。小鼠對A、B、C、D 4個酒樣及對照組的飲后行為參數(shù)比結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，與飲酒前小鼠行為參數(shù)相比，實驗組酒樣與對照組食用酒精在飲后不同時刻都會引起小鼠行為參數(shù)下降，整體表現(xiàn)為行為抑制狀態(tài)，迎駕貢酒A飲用后小鼠行為的抑制程度比食用酒精和其他酒樣明顯減弱，表現(xiàn)為適度抑制，差異極為顯著（P＜0.01），迎駕貢酒B飲用后小鼠行為的抑制程度處于食用酒精和其他濃香型白酒之間，但是差異不顯著（P＞0.05）。推測酒體成分是影響小鼠飲后自主行為變化差異的主要原因。

圖2 小鼠灌胃不同酒樣后在曠場中的行動距離比

2.2 小鼠飲酒后血漿乙醇和乙醛積累水平分析

乙醇進(jìn)入人體后隨血液流經(jīng)肝臟，首先被乙醇脫氫酶氧化為乙醛，該過程中會導(dǎo)致血液中乙醛的累積。乙醛再被乙醛脫氫酶轉(zhuǎn)化為乙酸，最終乙酸將被代謝為二氧化碳和水[16]。當(dāng)血液中乙醇濃度超過一定限度時，血流量增加而代謝作用卻下降。這就造成乙醇在腦中不能及時代謝排出，必然會引起頭痛、頭暈。乙醛會使人心跳加速，血壓升高，嗓子發(fā)干，頭暈頭痛[17]。利用氣相色譜法檢測血液中乙醇和乙醛的含量，可以幫助我們結(jié)合曠場實驗更好的判定小鼠感受，推斷濃香型白酒小鼠飲后舒適度。本實驗中，小鼠飲酒后0 h、2 h、5 h與24 h血漿乙醇和乙醛含量測定結(jié)果見圖3A和圖3B。

圖3A結(jié)果表明，飲酒后2 h，小鼠血漿中乙醇的積累程度由高到低分別是某濃香酒C、迎駕貢酒A、某濃香酒D、迎駕貢酒B、食用酒精。某濃香酒C與其他酒樣和食用酒精差異較為顯著（P＜0.01），迎駕貢酒A與其他酒樣和食用酒精差異較為顯著（P＜0.05），迎駕貢酒B與食用酒精差異較不顯著（P＞0.05）；飲酒后5 h，小鼠血漿中乙醇的積累程度由高到低分別是某濃香酒D、某濃香酒C、食用酒精、迎駕貢酒B、迎駕貢酒A，某濃香酒C與其他酒樣和食用酒精差異較為顯著（P＜0.05）；飲酒后24 h，所有酒樣的血漿乙醇濃度幾乎接近于零。

圖3 小鼠血漿乙醇(A)、血漿乙醛(B)含量測定結(jié)果

乙醇進(jìn)入機(jī)體后，先后經(jīng)肝臟乙醇脫氫酶及乙醛脫氫酶代謝轉(zhuǎn)化為乙醛和乙酸。圖3B結(jié)果表明，飲酒后2 h，小鼠血漿乙醛含量達(dá)到峰值，灌胃4個酒樣和食用酒精對血漿乙醛濃度的影響差異不顯著（P＞0.05）；飲酒后5 h，小鼠血漿中乙醛的積累程度由高到低分別是某濃香酒D、某濃香酒C、食用酒精、迎駕貢酒A和B，迎駕貢酒A和B差異不顯著（P＞0.05），但是迎駕貢酒產(chǎn)品和其他酒樣以及食用酒精差異較為顯著（P＜0.05）；飲酒后24 h，所有酒樣的血漿乙醛濃度仍然顯示有所積累，但是酒樣之間差異不大（P＞0.05）。

總體分析，迎駕貢酒A飲用后小鼠對酒精的代謝雖然在飲酒后2 h較低，但是后期代謝較快，迎駕貢酒B飲用后小鼠對酒精的代謝整體較快，迎駕貢酒A和B飲用后酒精轉(zhuǎn)化為乙醛在血漿中的積累程度要比其他酒低。結(jié)合酒后動物自主運(yùn)動行為參數(shù)及行為參數(shù)比的分析結(jié)果，認(rèn)為飲用迎駕酒樣A的小鼠行為沒有呈現(xiàn)過度抑制的狀態(tài)，可能是由于A酒樣進(jìn)入機(jī)體后乙醇累積量低和代謝速率快有關(guān)。推測酒體成分是影響小鼠飲后酒精代謝與乙醛轉(zhuǎn)化積累的主要原因。

2.3 影響迎駕貢酒飲后行為的關(guān)鍵酒體成分PCA分析

根據(jù)本實驗前期結(jié)果，推測酒體成分是影響小鼠飲后自主行為變化差異、酒精代謝與乙醛轉(zhuǎn)化積累的主要原因。為進(jìn)一步判斷酒樣中起重要作用的關(guān)鍵酒體成分，在此，本實驗使用SPSS 23.0軟件對以上物質(zhì)成分進(jìn)行主成分分析，以醇、醛、酸、酯每類物質(zhì)累計貢獻(xiàn)率達(dá)到93 %且特征根大于1的成分定義為主成分[18-20]，使用OriginPro 2018軟件作出PCA投影圖，結(jié)果如圖4所示，根據(jù)前期通過色譜對A、B、C、D 4款白酒進(jìn)行的酒體主要風(fēng)味物質(zhì)定量分析檢測結(jié)果（表1）。

圖4 A、B、C、D 4個酒樣中酒主要風(fēng)味物質(zhì)PCA投影圖

由圖4可知，各酒樣主成分（PAC）的權(quán)重與載荷各不相同，較為直觀地表明不同酒樣中不同主成分所代表的物質(zhì)的貢獻(xiàn)度。4個酒樣中，甲醇、異丁醇、活性戊醇、異戊醇、正戊醇、乙醛、乙縮醛、糠醛、異戊醛、乳酸、丙酸、甲酸、正丁酸、戊酸、己酸、丙酮酸、乙酸乙酯、庚酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、丁二酸二乙酯、丁酸乙酯在各自類別的主成分中都有較大貢獻(xiàn)度。

以上的醇類物質(zhì)在迎駕貢酒A和B中均不起主要作用，C酒樣以甲醇、異丁醇、活性戊醇、異戊醇起主要作用，D酒樣中正戊醇起主要作用；迎駕貢酒A和B以異戊醛起到主要作用，C酒樣以乙醛、乙縮醛、糠醛起主要作用，D酒樣以上醛類物質(zhì)均起主要作用；迎駕貢酒A和B以乳酸、丙酸、甲酸、正丁酸、戊酸、己酸起主要作用，C酒樣酸類物質(zhì)均不起主要作用，D酒樣丙酮酸起主要作用；A酒樣以乙酸乙酯、庚酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、丁二酸二乙酯起主要作用，B酒樣以丁酸乙酯起主要作用，C酒樣以上酯類物質(zhì)均不起主要作用，D酒樣以乙酸乙酯、庚酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、丁二酸二乙酯起到主要作用。

表1 A、B、C、D 4個酒樣醇類、醛類、酯類和酸類物質(zhì)含量 (mg/L)

結(jié)合飲酒后小鼠行為及血液乙醇和乙醛代謝及積累程度的結(jié)果綜合分析，結(jié)果認(rèn)為，某濃香白酒C組小鼠在飲酒后2 h和5 h表現(xiàn)出過度抑制，相對應(yīng)的2 h血液乙醇累積量也最高，與酒樣C中發(fā)揮主要作用的異丁醇、活性戊醇、異戊醇、異戊醛含量較高有關(guān)；飲用迎駕酒樣A的小鼠行為沒有呈現(xiàn)過度抑制的狀態(tài)，表現(xiàn)為適度放松，A酒樣進(jìn)入機(jī)體后乙醇累積量低和代謝速率快，與A酒樣中乳酸、丙酸、甲酸、正丁酸、戊酸、己酸的含量較高有關(guān)。此外，A酒樣中主要酯類物質(zhì)含量較低，后期需要對所推測的迎駕貢酒飲后舒適度起關(guān)鍵作用的酒體成分進(jìn)行深入分析確定。

3 結(jié)論及展望

中國白酒已成為人們追求高質(zhì)量、高品位的時尚消費品。較高飲后舒適度的白酒要求在飲后自主行為表現(xiàn)上首先能夠自我控制，并在此基礎(chǔ)上達(dá)到適度興奮和適度放松的狀態(tài)，充分讓消費者享受到飲酒帶來的愉悅放松的感受。對飲酒后舒適度的科學(xué)客觀的評價手段是目前行業(yè)重要的關(guān)注問題之一。曠場實驗是受試動物在刺激下模擬人的行為的試驗系統(tǒng)，側(cè)重以科學(xué)和客觀的實驗方法研究動物的各種行為，通過分析其行為來實現(xiàn)對動物情緒、狀態(tài)等現(xiàn)象的深入研究，是現(xiàn)代動物模型實驗研究的重要技術(shù)。我們前期建立了以精細(xì)行為和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)綜合研究為基礎(chǔ)的飲酒后行為與感受層面的飲后舒適度評價模型[21-22]。本研究以此模型對迎駕貢酒不同產(chǎn)品等濃香型白酒產(chǎn)品的飲后舒適度評價，同時結(jié)合飲酒后血液乙醇和乙醛代謝及積累程度的分析，發(fā)現(xiàn)了不同產(chǎn)品之間在飲酒后行為變化及酒精代謝程度存在差異性，推測酒體主要的風(fēng)味物質(zhì)成分有關(guān)，同時結(jié)合酒體風(fēng)味成分的主成分PCA分析，對酒樣中在飲后舒適度起關(guān)鍵作用的酒體風(fēng)味成分進(jìn)行初步研究，初步推斷引起飲后舒適度不高，行為表現(xiàn)過度抑制的原因可能與酒體中高級醇、醛類含量過高，酸類物質(zhì)含量較低，酸酯比例不協(xié)調(diào)有關(guān)。本實驗結(jié)果為迎駕貢酒及其他白酒高舒適度的酒體設(shè)計以及產(chǎn)品品質(zhì)提高提供研究支持。