張龍云，蒲 春，高 濤

(江蘇洋河酒廠股份有限公司，江蘇宿遷 223800)

白酒是以富含淀粉質(zhì)的糧谷類為原料，以酒曲為糖化發(fā)酵劑，主要采用固態(tài)發(fā)酵，經(jīng)蒸餾、貯存和勾調(diào)而成的含酒精的飲料[1]。白酒生產(chǎn)在中國具有悠久的歷史，一直深受人們的喜愛，且因原料種類和配比、酒曲種類和生產(chǎn)工藝以及自然環(huán)境等因素的不同，形成了不同特色不同香型的白酒[2]。結(jié)合白酒的生產(chǎn)工藝可以看出，微生物參與淀粉糖化、酒精發(fā)酵、產(chǎn)酯生香等生化過程，對于白酒風(fēng)格的形成起到至關(guān)重要的作用[3]。白酒的生產(chǎn)是開放式多菌種共同發(fā)酵[4]，釀造環(huán)境對開放式的生產(chǎn)模式具有很重要的影響，尤其是空氣環(huán)境，整個白酒生產(chǎn)過程均與空氣接觸，而空氣中存在大量微生物孢子，空氣為釀酒微生物遷移運動提供了媒介，為白酒生產(chǎn)提供了大量不同種類的細(xì)菌、霉菌和酵母菌等。細(xì)菌在釀酒微生物群落中扮演重要角色，主要參與形成白酒復(fù)雜的風(fēng)味和香氣[5]，尤其是對白酒中乳酸、乙酸、丁酸、己酸及其對應(yīng)的乙酯以及α-聯(lián)酮化合物的生成有重大貢獻(xiàn)。本試驗從洋河酒廠釀造環(huán)境中篩選優(yōu)勢細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，通過形態(tài)學(xué)和生理生化方法進(jìn)行初步分類鑒定，并對單株菌發(fā)酵培養(yǎng)后的代謝產(chǎn)物進(jìn)行頂空氣相色譜分析，根據(jù)其發(fā)酵特性將其應(yīng)用到芝麻香型白酒大曲生產(chǎn)中。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 研究對象

以洋河酒廠的2個一區(qū)釀酒車間和2個二區(qū)釀酒車間的釀造環(huán)境為研究對象，主要是場區(qū)釀酒車間窖池周圍空氣、工作環(huán)境空氣以及大曲、酒醅、窖泥、黃水、操作工具等。

1.1.2 試劑與儀器

試劑：葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、無機(jī)鹽、氫氧化鈉、氯化鈉等均購于國藥集團(tuán)，為分析純；麩皮，市售；生化鑒定管購于青島海博生物技術(shù)有限公司。

儀器：PHS-3E臺式pH計，LDZH-200KBS立式滅菌鍋，DNP-9162A電熱恒溫培養(yǎng)箱，島津氣質(zhì)聯(lián)用儀，HW-150C溫控振蕩培養(yǎng)箱，90-3恒溫雙向磁力攪拌器，SPME手動萃取裝置，Agilent GCMS/7890A-5975C聯(lián)用儀。

1.1.3 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，酵母膏5 g，蒸餾水1000 mL，121 ℃滅菌20 min。固體培養(yǎng)基加2%瓊脂。

麩皮固體培養(yǎng)基：麩皮100 g，加水70 mL，攪拌均勻后，121 ℃滅菌20 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 空氣采樣

采樣方法為自然沉降法,分別在窖池周圍與工作環(huán)境選定5個采樣點，每個點做3個平行，將平皿暴露于空氣中5 min。采樣后37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察記錄細(xì)菌的種類和數(shù)量。采用中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)確定的公共場所每立方米空氣中微生物總數(shù)的計算公式[6]計算空氣中細(xì)菌的濃度。

公式為：E=1000×50 N/At

式中：E為單位體積內(nèi)空氣細(xì)菌數(shù)（cfu/m3）；

A為培養(yǎng)皿的面積(cm2)；

t為培養(yǎng)皿暴露時間(min)；

N為培養(yǎng)皿中細(xì)菌菌落數(shù)。

1.2.2 生產(chǎn)工具采樣

用無菌棉簽蘸取無菌水來回擦拭工具表面，放入取樣袋帶回。在實驗室無菌操作，將棉簽放入裝有約2 mL無菌水的小試管，振蕩使樣品溶于水中，取200 μL樣品溶液平板涂布。在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察記錄細(xì)菌的種類和數(shù)量。

1.2.3 固形物及液體采樣

稱10 g樣品溶于90 mL無菌水的三角瓶中，120 r/min振蕩搖勻30 min，再用試管依次梯度稀釋后涂布平板，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察記錄細(xì)菌的種群和數(shù)量。

1.2.4 產(chǎn)香細(xì)菌的篩選

將斜面保存的細(xì)菌分別接種到裝液量300 mL和500 mL三角瓶肉湯培養(yǎng)基，置于37 ℃搖床培養(yǎng)24 h后，以10 %接種量接種于麩皮固態(tài)培養(yǎng)基1000 mL三角瓶中37 ℃固態(tài)培養(yǎng)6 d，以感官評定的方法對產(chǎn)香細(xì)菌進(jìn)行初篩，重點篩選能產(chǎn)生醬香的細(xì)菌。

1.2.5 生理生化試驗

生理生化試驗原理和方法參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[7-8]。

1.2.6 頂空固相萃取條件

稱取0.5 g樣品，5 mL飽和氯化鈉于頂空瓶中。將頂空瓶置于50 ℃水浴中恒溫10 min（將水浴杯置于磁力攪拌器上），插入75 μm CAR/PDMS on PDMS萃取纖維頭頂空吸附30 min，于250 ℃解吸5 min后進(jìn)行GC-MS分離鑒定。

氣相色譜條件：DB-WAX色譜柱(30m×0.25mm，0.25 μm)；載氣為He，流速1 mL/min；程序升溫：起始溫度40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升溫速率升至80 ℃，最后以10 ℃/min升至230 ℃/min保持7 min；汽化室溫度250 ℃；不分流[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 場區(qū)空氣細(xì)菌的分布特征

以洋河酒廠的2個一區(qū)釀酒車間和2個二區(qū)釀酒車間的釀造環(huán)境空氣為研究對象，利用自然沉降法采集場區(qū)釀酒車間窖池周圍空氣和工作環(huán)境空氣樣本，進(jìn)行細(xì)菌適溫培養(yǎng)，并對細(xì)菌進(jìn)行種類和菌體濃度統(tǒng)計。由圖1可知，一區(qū)環(huán)境空氣中細(xì)菌的菌體濃度明顯多于二區(qū)環(huán)境空氣中細(xì)菌的菌體濃度，工作場所環(huán)境空氣中細(xì)菌的菌體濃度明顯多于窖池環(huán)境空氣中細(xì)菌的菌體濃度，其中一區(qū)窖池環(huán)境空氣中細(xì)菌菌體濃度是二區(qū)窖池環(huán)境空氣中細(xì)菌菌體濃度的1.75倍，一區(qū)工作場所環(huán)境空氣中細(xì)菌菌體濃度是二區(qū)工作場所環(huán)境空氣中細(xì)菌菌體濃度的2.26倍，這是因為空氣中的細(xì)菌是白酒釀造微生物的重要來源之一,老產(chǎn)區(qū)窖池因發(fā)酵生產(chǎn)時間長，富集的細(xì)菌較多，因而窖池中細(xì)菌與周圍環(huán)境空氣遷移的較為頻繁，使老產(chǎn)區(qū)窖池環(huán)境空氣的細(xì)菌菌體濃度明顯高于二區(qū)窖池環(huán)境空氣中的細(xì)菌菌體濃度，同時工作場所是酒醅加曲前處理的場所，曲中細(xì)菌濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過空氣中細(xì)菌濃度，與空氣細(xì)菌進(jìn)行交互，會提高空氣中細(xì)菌菌體濃度，且一區(qū)生產(chǎn)釀造時間更長，工人的操作使得空氣流動更快，最終結(jié)果是空氣中富集的細(xì)菌也更多，所以一區(qū)工作場所環(huán)境空氣中細(xì)菌菌體濃度顯著超過二區(qū)工作場所環(huán)境空氣中細(xì)菌濃度，工作場所環(huán)境空氣中細(xì)菌菌體濃度顯著高于窖池環(huán)境空氣中的細(xì)菌菌體濃度。由圖2可知，一區(qū)環(huán)境空氣中細(xì)菌種類比二區(qū)環(huán)境空氣中的細(xì)菌種類多，工作場所環(huán)境空氣中細(xì)菌種類比窖池環(huán)境空氣中的細(xì)菌種類多。主要原因是一區(qū)生產(chǎn)使用時間長，經(jīng)過長時間的馴化和適應(yīng)，更加利于細(xì)菌生長，使環(huán)境空氣中擁有更多的細(xì)菌種類；工作場所環(huán)境空氣比窖池環(huán)境空氣相對更開放，同時由于生產(chǎn)操作，它的流動性也更強(qiáng)，所以能富集更多種的細(xì)菌。白酒的生產(chǎn)是開放式多菌種共同發(fā)酵，與空氣接觸較多，空氣微生物會對發(fā)酵產(chǎn)生重要影響，空氣微生物數(shù)量和種類越豐富對白酒發(fā)酵生產(chǎn)越有利，從場區(qū)空氣細(xì)菌種類和菌體濃度上來看，一區(qū)微生物組成與結(jié)構(gòu)更加豐富和穩(wěn)定。環(huán)境中共提取到29株細(xì)菌，優(yōu)勢菌菌落形態(tài)如圖3，從顯微鏡鏡檢的結(jié)果表明，環(huán)境空氣中芽孢桿菌占大多數(shù)。

2.2 產(chǎn)香風(fēng)味細(xì)菌的篩選

在麩皮固體培養(yǎng)基上接種細(xì)菌種子液，37 ℃培養(yǎng)6 d，每天進(jìn)行一次感官評定并記錄。隨著培養(yǎng)進(jìn)行，陸續(xù)篩選出10株能在麩皮固體培養(yǎng)物產(chǎn)生醬香味較為明顯的細(xì)菌，以此作為下一步復(fù)篩的出發(fā)菌株。

圖1 不同功能區(qū)空氣細(xì)菌濃度分布特征

圖2 不同功能區(qū)空氣細(xì)菌種類分布特征

2.3 產(chǎn)香風(fēng)味細(xì)菌的培養(yǎng)特征

菌株在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上菌落特征見表1。其中，1#、7#和10#菌落形態(tài)相似，菌苔厚，呈乳脂狀；3#、6#和9#菌落形態(tài)相似，菌苔薄，略透明；2#、4#、5#和8#菌落形態(tài)相似，菌落邊緣呈絲毛狀不整齊，產(chǎn)生淡紅色色素。

顯微觀察菌株的細(xì)胞形態(tài)特征見表2。這10株菌都是芽孢桿菌，按菌體寬度大致可分為3個標(biāo)準(zhǔn)，圖4分別是具有代表性的1#、6#、10#細(xì)菌。

菌株的生理生化特征見表3。經(jīng)16s rRNA鑒定，1#菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）；2#、5#、6#、8#、9#菌株為凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）；3#菌株為地衣芽孢桿菌（Bacillus lichenifor-mis）；4#菌株為多粘類芽孢桿菌（Bacillus polymyxa）；7#、10#菌株為環(huán)狀芽孢桿菌（Bacillus circu-lans）。

圖3 釀酒空氣中優(yōu)勢菌落形態(tài)

表1 菌株的培養(yǎng)特征

表2 菌株的細(xì)胞形態(tài)特征

圖4 1#、6#、10#細(xì)菌形態(tài)

表3 菌株的生理生化特征

2.4 細(xì)菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物分析

圖5 代表菌株2#吡嗪類化合物氣相色譜圖

將10株細(xì)菌純種液態(tài)培養(yǎng)后，氣相色譜分析液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物。同時，接種于麩皮培養(yǎng)基中，利用頂空固相微萃取-氣質(zhì)連用方法，分析10株細(xì)菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物。

經(jīng)過分析可知，10株細(xì)菌定性到的化合物數(shù)量和種類都較多，既有相同的風(fēng)味物質(zhì)，又有獨特的風(fēng)味化合物：10株細(xì)菌分別定性到20種、24種、27種、28種、28種、17種、27種、29種、38種、31種含量較多的風(fēng)味化合物，其中9#菌產(chǎn)風(fēng)味物數(shù)量最多；這些代謝風(fēng)味化合物主要集中在吡嗪類化合物、芳香族化合物、醛類、酮類、多元醇、烯醇類、呋喃類化合物及其他雜環(huán)化合物等，還有少量的酸類、酯類、噻唑、噻吩、吡啶、吡咯化合物。其中吡嗪類化合物，主要有三甲基吡嗪、四甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,4-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2，3，5-三甲基-6-乙基吡嗪、2-乙基-3，5-二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪等，吡嗪類化合物蒸汽壓低、易揮發(fā)，且香勢強(qiáng)、香味閾值低，在食品中作為重要的風(fēng)味物質(zhì)。四甲基吡嗪是構(gòu)成芝麻香和醬香風(fēng)味的重要風(fēng)味物質(zhì)，可以為酒體提供充足的焙烤香氣和焦香味；并且定性到吡嗪類化合物的前體2,3-丁二醇、3-羥基-2-丁酮（醋酉翁）等化合物，2,3-丁二醇在2#和7#菌株中定性到；3-羥基-2-丁酮/醋嗡在1#、3#、4#、6#、7#、8#、9# 7株菌中定性到，2,3-丁二醇和其他多元醇在酒中起助香作用，能增加口味綿、甜、柔軟、細(xì)膩感[10]，3-羥基-2-丁酮（醋酉翁）可以增加酒的悠長后味，嗜熱芽孢桿菌可以代謝這些物質(zhì)形成吡嗪類化合物；芳香族化合物中苯酚、β-苯乙醇、愈創(chuàng)木酚（2-甲氧基苯酚）、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚等含量較高。同時，運用內(nèi)標(biāo)法計算，進(jìn)一步對幾種典型風(fēng)味物質(zhì)含量進(jìn)行定量分析，結(jié)果如表4、圖6。

表4 功能性細(xì)菌典型風(fēng)味化合物含量表

圖6 典型風(fēng)味物質(zhì)色譜圖

由表4可知，吡嗪類化合物中四甲基吡嗪和三甲基吡嗪在各菌株中產(chǎn)量相對豐富，四甲基吡嗪產(chǎn)量最高的是8#菌，達(dá)到了3.49（×10-10g/g），其次是5#菌3.08（×10-10g/g）其他菌種也檢測到，但含量相對較低；β-苯乙醇只在4#、5#、8#和10#中，并且含量相差不大；酚類物質(zhì)主要是愈創(chuàng)木酚和4-乙烯基愈創(chuàng)木酚，愈創(chuàng)木酚產(chǎn)量最高的是2#菌4.51（×10-10g/g），其次是1#菌3.57（×10-10g/g），4-乙烯基愈創(chuàng)木酚產(chǎn)量最高的也是2#菌29.98（×10-10g/g）。β-苯乙醇具有濃郁的水果和蜂蜜的香氣，能夠賦予酒體自然發(fā)酵的香氣，愈創(chuàng)木酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚則可以提供較多的堅果類香氣，賦予酒體成熟的焦香、醬香，可以賦予調(diào)味酒較多的醬香感。

通過本研究，初步確定了10株菌種液態(tài)和固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物。其中，有些風(fēng)味物質(zhì)如吡嗪類、多酚類等是芝麻香和醬香風(fēng)味的重要風(fēng)味物質(zhì)，為酒體提供充足的焙烤香氣和焦香味，豐富了口感，為菌種進(jìn)一步應(yīng)用提供了參考。

3 結(jié)論

分析車間釀造環(huán)境中微生物，感官評定法篩選出10株產(chǎn)芝麻香細(xì)菌，形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗、16s rDNA序列分析后，鑒定1#菌為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）；2#、5#、6#、8#、9#菌為凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）；3#菌為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）；4#菌為多粘類芽孢桿菌（Bacillus polymyxa）；7#、10#菌為環(huán)狀芽孢桿菌（Bacillus circulans）。通過氣相色譜分析液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物和頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用分析固態(tài)產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)這10株產(chǎn)芝麻香細(xì)菌，代謝產(chǎn)物主要為吡嗪類化合物、芳香族化合物、醛類、酮類、多元醇、烯醇類、呋喃類化合物及其他雜環(huán)化合物等，還有少量的酸類、酯類、噻唑、噻吩、吡啶、吡咯化合物，其中代謝產(chǎn)物中有很多與芝麻香風(fēng)味形成有關(guān)的化合物和其前體物質(zhì)，有三甲基吡嗪、四甲基吡嗪、2,3-丁二醇、3-羥基-2-丁酮、β-苯乙醇、愈創(chuàng)木酚和4-乙烯基愈創(chuàng)木酚。此外芽孢桿菌在高溫制曲方面有很大的應(yīng)用前景，在此基礎(chǔ)上，今后將對菌株的耐熱特性，產(chǎn)糖化酶、液化酶和蛋白水解酶活力，以及產(chǎn)特殊香味物質(zhì)做進(jìn)一步研究，以期應(yīng)用于芝麻香高溫大曲的研制。