□ 魏萬彩 石紅霞 唐 麗 張亞麗 蘭州中檢科測(cè)試技術(shù)有限公司

細(xì)菌在自然界中無處不在，其在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖而形成的能被肉眼識(shí)別的生長(zhǎng)物即菌落，是由數(shù)以萬計(jì)的相同的細(xì)菌集合而成。當(dāng)樣品被稀釋到一定程度時(shí)，接種于培養(yǎng)基上，在一定培養(yǎng)條件下，每個(gè)能夠生長(zhǎng)繁殖的細(xì)菌都可以在平板上形成一個(gè)可見的菌落[1]。菌落總數(shù)是指食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下如培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間等培養(yǎng)后，所得每g(mL)檢樣中形成的微生物菌落總數(shù)[2]。它們是實(shí)現(xiàn)食品安全的最大攔路虎，因此對(duì)菌落總數(shù)進(jìn)行不確定度評(píng)定很有必要。本文通過分析影響食品中菌落總數(shù)測(cè)定的不確定度來源，建立一種較為簡(jiǎn)單的菌落總數(shù)不確定度評(píng)定方法。

1 檢驗(yàn)方法

依據(jù)GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》進(jìn)行檢驗(yàn)，檢驗(yàn)流程如下：取待測(cè)樣品25 mL，加入225 mL生理鹽水，用拍擊式均質(zhì)器拍打2 min，制成1：10的樣品勻液，用1 mL無菌吸管吸取1：10樣品勻液1 mL，沿管壁緩慢注于盛有9 mL生理鹽水的無菌試管中，制成1：100的樣品勻液。分別吸取1：10和1：100的樣品勻液于無菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。同時(shí)，分別吸取1 mL空白生理鹽水，加入到兩個(gè)無菌平皿內(nèi)作空白對(duì)照。及時(shí)將15～20 mL冷卻至46 ℃的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基傾注于平皿內(nèi)，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿均勻分布在平皿內(nèi)。待瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，36 ℃培養(yǎng)48 h。最后計(jì)數(shù)并報(bào)告結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)所采用樣品為某公司生產(chǎn)的同一批次醬油，檢驗(yàn)合格待銷售。

2 不確定度來源及數(shù)學(xué)模型

2.1 不確定度來源分析

本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照GB 4789.2—2016中的規(guī)定執(zhí)行，不確定因素如下[3]。

（1）樣品因素：樣品是統(tǒng)一生產(chǎn)并包裝的，為液體狀態(tài)，均勻且穩(wěn)定，基本不影響。

（2）稱量及10倍稀釋因素：天平及移液器經(jīng)檢定合格，基本不影響。

（3）培養(yǎng)箱、培養(yǎng)基及試劑因素：培養(yǎng)箱溫度均經(jīng)過校準(zhǔn)，校準(zhǔn)合格。培養(yǎng)基為北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，檢測(cè)合格，基本不影響。

（4）人員因素：不同人員存在偏差，同一人員多次操作存在小差異。

由此可以看出，菌落總數(shù)測(cè)定不確定度主要來源于以上幾個(gè)方面，這些不確定因素最后都體現(xiàn)在檢測(cè)結(jié)果上，并且檢測(cè)結(jié)果發(fā)散較大，與其相比，其他不確定因素都可以忽略，只考慮測(cè)量結(jié)果發(fā)散的不確定度即可。

2.2 數(shù)學(xué)模型

設(shè)菌落總數(shù)為y，檢測(cè)結(jié)果為x，則數(shù)學(xué)模型為：y=x（CFU/mL）

3 不確定度評(píng)定

3.1 單一樣品的重復(fù)檢測(cè)

同一樣品在一段時(shí)間內(nèi)重復(fù)檢測(cè)20次，每一樣品均做平行樣，取其平均值作為檢測(cè)結(jié)果，20次檢測(cè)結(jié)果見表1。

表1 單一樣品的重復(fù)檢測(cè)結(jié)果表

3.1.1 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

3.1.2 擴(kuò)展不確定度

由于置信概率p=95%，自由度v=20—1=19，由t分布可查得k=2.093；則U95置信概率為p=95%時(shí)的擴(kuò)展不確定=2.093×0.035448=0.074

所以lgx=2.476±0.074，即2.402≤lgx≤2.550，取反對(duì)數(shù)，得252≤x≤354。

3.1.3 不確定度報(bào)告

該被測(cè)樣品菌落總數(shù)為252～354 CFU/mL。

3.2 一組樣品的重復(fù)檢測(cè)

分6次對(duì)6個(gè)不同時(shí)間獲得的樣品進(jìn)行檢測(cè)，每份樣品重復(fù)檢測(cè)兩次，則第j個(gè)樣品的檢測(cè)結(jié)果分別為x1j和x2j。檢測(cè)結(jié)果見表2。

3.2.1 樣本標(biāo)準(zhǔn)差

表2 一組樣品的重復(fù)檢測(cè)結(jié)果

表3 lgxj的區(qū)間形式表示表

3.2.2 兩次檢測(cè)平均值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

3.2.3 擴(kuò)展不確定度

取置信概率p=95%，自由度v=6—1=5，由t分布可查得k=2.57，則可得擴(kuò)展不確定度

3.2.4 檢測(cè)結(jié)果區(qū)間范圍

根據(jù)lgxj計(jì)算每一樣品的菌落總數(shù)所在區(qū)間范圍（見表3）。

4 結(jié)果與結(jié)論

本次實(shí)驗(yàn)對(duì)平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基、生理鹽水、無菌袋、試管和吸管等做了相應(yīng)的空白驗(yàn)證，同時(shí)對(duì)潔凈室臭氧滅菌效果進(jìn)行了環(huán)境監(jiān)測(cè)，結(jié)果均符合要求。排除這些因素后，可以看出，菌落總數(shù)檢測(cè)結(jié)果的發(fā)散性較大，重復(fù)檢測(cè)結(jié)果差值達(dá)3倍，與其相比其他所有不確定度來源都可以忽略。