□ 羅 驍 吳帥龍 李彩玲 廣電計(jì)量檢測（合肥）有限公司

維生素D3與維生素D2為脂溶性維生素，主要功用是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長分化和人體免疫功能，有利于新骨生成和鈣化，促進(jìn)骨骼生長[1]，預(yù)防骨質(zhì)疏松癥。但維生素D攝入過多，可引起高血鈣、甚至軟組織異位骨化等[2]。因此準(zhǔn)確、方便測定保健食品中維生素D3的含量有著重要意義。

維生素D的分析多采用高效液相色譜法（HPLC—UV）和液相色譜—質(zhì)譜法。其中高效液相色譜法需要在酶解皂化反應(yīng)后，采用正相色譜凈化測定，前處理復(fù)雜、費(fèi)時(shí)；液相色譜—質(zhì)譜法具有高靈敏度、高通量及高選擇性等特點(diǎn)，但設(shè)備和試劑價(jià)格昂貴，影響其推廣使用。本文使用維生素D2為內(nèi)標(biāo)，高效液相色譜法測定保健品中維生素D3，測定維生素D2時(shí)，使用維生素D3為內(nèi)標(biāo)，無需色譜凈化，簡化了操作步驟，維生素D2替代昂貴的同位素內(nèi)標(biāo)，降低基質(zhì)效應(yīng)，提高了定量準(zhǔn)確性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

電子天平（十萬分之一，Mettler—Toledo），高效液相色譜儀（LC—20A，二極管陣列檢測器，Shimadzu）。

維生素D2（BePure，98.0%±2%），維生素D3（BePure，99.3%±1%），抗壞血酸（山東西亞，GR，99.5%），正己烷石油醚（30～60 ℃），無水硫酸鈉，甲醇，淀粉酶（活力單位≥100 U/mg）。

1.2 色譜條件

色譜柱：C18柱，250 mm×4.6 mm，5 μm；流動相：甲醇+水=95+5；流速：1 mL/min；

柱溫：35 ℃；檢測器波長：264 nm；進(jìn)樣體積：50 μL。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品配制與樣品處理

稱取維生素D2、維生素D3標(biāo)準(zhǔn)品各10.0 mg，乙醇溶解定容至100 mL，濃度為10 μg/mL，并轉(zhuǎn)移至棕色試劑瓶待用。用流動相配制系列維生素D3工作標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加入0.05 mL維生素D2標(biāo)準(zhǔn)溶液，95%的甲醇定容至10 mL。

維生素D易于被氧化，樣品處理過程對分析結(jié)果的準(zhǔn)確性有決定性影響[3]。參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中維生素A、D、E的測定》（GB 5009.82—2016）第四法，準(zhǔn)確稱量某品牌保健食品（片劑，打磨成均勻粉狀，過篩）5.000 g試樣于平底燒瓶中，加入溫水和1.00 mL濃度為1 μg/mL的維生素D2標(biāo)準(zhǔn)溶液和1 g淀粉酶，60 ℃恒溫水浴振蕩40 min，酶解液中依次加入1.0 g抗壞血酸、0.1 g BHT、30 mL無水乙醇、20 mL氫氧化鉀溶液（50%），65 ℃回流皂化50 min，用20 mL×2石油醚萃取，合并醚層。水洗醚層至中性，經(jīng)無水硫酸鈉過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約2 mL，40 ℃水浴氮吹至干，加入1.0 mL甲醇溶解，微孔濾膜過濾，上機(jī)測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 線性范圍與定量限

用加入了0.5 μg維生素D2（維生素D3）作為內(nèi)標(biāo)的系列濃度維生素D2（維生素D3）標(biāo)準(zhǔn)溶液上機(jī)測定；內(nèi)標(biāo)法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時(shí)，取空白樣品，按“1.3”方法處理后，添加維生素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以3倍信噪比（S/N=3）確定其檢出限，10倍信噪比（S/N=10）確定其定量限。維生素D的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)（r2）、線性范圍及檢測低限結(jié)果見表1。

表1 線性方程、相關(guān)系數(shù)（r2）及定量下限

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，此方法條件下，維生素D2、D3的分離度達(dá)到1.5，在0.01～5.0 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性，相關(guān)系數(shù)（r2）均大于0.99，定量限＜1.0 μg/100 g。靈敏度較高。

2.2 精密度與準(zhǔn)確度

使用廠家提供的空白樣品，依據(jù)一般市售保健食品中維生素含量，設(shè)定維生素的低、中、高3個維生素D2、D3添加水平分別為：80 μg/100 g、160 μg/100 g、240 μg/100 g， 做 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，重復(fù)實(shí)驗(yàn)6次，同時(shí)考察相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見表2。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，維生素D2、D3回收率在96.23%～104.26%，RSD為2.82%～5.10%。方法的精密度與準(zhǔn)確度滿足定量分析要求。

2.3 實(shí)際樣品檢測

對7種市售稱有增加骨密度作用的保健品（片劑）中的維生素D3進(jìn)行測定，

表2 維生素的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

VD3含量分布在67.53～172.42 μg/100 g。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)建立了液相色譜—紫外檢測器，內(nèi)標(biāo)法檢測保健食品中維生素D2、D3含量的方法，兩者分離度達(dá)到1.5在0.01～5.0μg/mL濃度范圍內(nèi)有良好線性，加標(biāo)回收率為97.77%～106.56%。當(dāng)取樣量為5.000 g時(shí)，維生素D2、D3的定量限分別為0.65 μg/100 g、0.57 μg/100 g，滿足保健品中維生素D定量分析要求。