袁 航 丁同英

(無(wú)錫城市職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214000)

真菌毒素是由真菌分泌的一類天然代謝產(chǎn)物，食品生產(chǎn)的每個(gè)階段均可產(chǎn)生，會(huì)污染食品，并通過(guò)食物或動(dòng)物飼料間接傳遞給消費(fèi)者，對(duì)人類健康造成威脅。食品中真菌毒素的存在是全球關(guān)注的問(wèn)題，聯(lián)合國(guó)糧食與農(nóng)業(yè)組織(FAO)統(tǒng)計(jì)，全球糧食有25%受到真菌毒素污染[1]，其中對(duì)食品安全威脅最大的真菌毒素包括黃曲霉毒素(AFs)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)、玉米赤霉烯酮(ZEN)等[2]。隨著科學(xué)家們對(duì)真菌毒素毒性的不斷探索與研究，真菌毒素給國(guó)家經(jīng)濟(jì)、人民健康帶來(lái)的危害逐漸明晰，越來(lái)越多的消費(fèi)者開始注重食品安全，越來(lái)越多的企業(yè)和機(jī)構(gòu)關(guān)注如何精準(zhǔn)檢測(cè)和消減食物中真菌毒素，很多國(guó)家和地區(qū)也出臺(tái)了食品中真菌毒素限量規(guī)定，這些均有力地推動(dòng)了各種毒素檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展。從經(jīng)典的薄層色譜法到生物芯片等新型技術(shù)，食品安全檢測(cè)技術(shù)有了巨大的進(jìn)步，但目前如何便捷高效準(zhǔn)確地測(cè)定食品中真菌毒素含量仍是研究的重中之重，對(duì)于食品安全具有重大意義。文章擬綜述真菌毒素的主要類型以及檢測(cè)方法，分析各方法的優(yōu)缺點(diǎn)，并對(duì)其未來(lái)發(fā)展方向進(jìn)行展望，以期為食品安全監(jiān)控以及未來(lái)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展提供依據(jù)。

1 食品中主要真菌毒素種類

1.1 黃曲霉毒素(AFs)

AFs主要是由黃曲霉和寄生曲霉等霉菌產(chǎn)生，在玉米、大豆、花生等糧油產(chǎn)品、堅(jiān)果類產(chǎn)品、乳制品中易被檢出。AFs有B1、B2、B2a、G1、G2、M1等多種類型，其中AFB1毒性最強(qiáng)[3]，若被人體食用，輕則膽管增生，重則引起肝臟病變甚至癌變，同時(shí)對(duì)食用者后代仍具有致癌、致畸作用[4]。目前對(duì)于食品中AFs的檢測(cè)主要有薄層色譜法、高效液相色譜法以及免疫分析法等[5]。

1.2 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)

DON又稱嘔吐毒素(Vomitoxin)，主要由禾谷鐮刀菌和粉紅鐮刀菌在低溫、潮濕的環(huán)境中產(chǎn)生，污染小麥等糧農(nóng)產(chǎn)品。DON的理化性質(zhì)穩(wěn)定，在日常烹飪和加工中難以被破壞[6]，進(jìn)入人體后，會(huì)產(chǎn)生頭疼、發(fā)燒、嘔吐等不良反應(yīng)[7]，DON還可與其他毒素一起產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，誘發(fā)更大的生理毒性[8]。近幾年糧食企業(yè)檢測(cè)DON時(shí)廣泛應(yīng)用基于間接酶聯(lián)免疫原理的試劑盒法，而高效液相色譜法仍是實(shí)驗(yàn)室常用的DON檢測(cè)手段[9]。

1.3 鏈格孢霉毒素(Alternaria toxins)

鏈格孢霉毒素是一種新發(fā)現(xiàn)的真菌毒素，存在于植物、種子、農(nóng)產(chǎn)品、大氣和土壤中[10]，其主要代謝產(chǎn)物—鏈格孢酚(AOH)、鏈格孢酚單甲醚(AME)、細(xì)交鏈孢菌酮酸(TeA)、騰毒素(TEN)等毒素具有誘變性、慢性及急性毒性和三致效應(yīng)[11-12]，可污染食物，使哺乳類動(dòng)物頭暈、嘔吐以及運(yùn)動(dòng)功能障礙，最終導(dǎo)致死亡[13-14]。近幾年因鏈格孢霉毒素引起的健康風(fēng)險(xiǎn)已備受關(guān)注，但目前缺乏針對(duì)食品中鏈格孢霉毒素制定監(jiān)管限制或監(jiān)測(cè)指南，關(guān)于其限量規(guī)定也尚未見(jiàn)報(bào)道[15-17]，多數(shù)采用LC-MS法檢測(cè)鏈格孢霉毒素[18]。

2 傳統(tǒng)檢測(cè)方法

2.1 薄層色譜法(TLC)

TLC法于1990年被列為AOAC標(biāo)準(zhǔn)方法，是檢測(cè)真菌毒素的經(jīng)典方法，通過(guò)對(duì)待測(cè)毒素進(jìn)行提取濃縮及薄層分離，在紫外光下進(jìn)行顯色反應(yīng)，依據(jù)熒光特性進(jìn)行定性分析，根據(jù)熒光斑點(diǎn)的大小進(jìn)行定量分析[19-20]，該法多用于食品藥品領(lǐng)域。Rocha等[21]采用基于QuEChERS的TLC法對(duì)巴西南部地區(qū)48個(gè)小麥面粉樣品中DON含量進(jìn)行分析，檢測(cè)限和定量限分別為30，100 ng/mL，回收率為80.2%～105.4%，變異系數(shù)<10%，證明該法用于DON評(píng)價(jià)是可靠的。TLC法成本低，樣品前處理簡(jiǎn)單，但是靈敏度低，只能定量，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，目前逐漸被其他方法所取代。

2.2 氣相色譜(GC)及氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)技術(shù)

GC是一種常用于青霉素、鏈格孢霉毒素的檢測(cè)手段，在測(cè)定ZEN時(shí)需先進(jìn)行衍生化，其所用試劑對(duì)濕度敏感，有一定的局限性。而GC-MS的出現(xiàn)既避免了GC難以定性的劣勢(shì)，又彌補(bǔ)了MS無(wú)法分析的缺點(diǎn)，被應(yīng)用于醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域[22]。Mcmaster等[23]為克服基質(zhì)干擾和信號(hào)抑制，將穩(wěn)定同位素d1-DON作為內(nèi)標(biāo)加入到傳統(tǒng)的GC-MS中，使用這種改進(jìn)的穩(wěn)定同位素稀釋法(SIDA)測(cè)定了98份高粱品種196份樣品中的DON含量。通過(guò)采用改進(jìn)的SIDA，基于d1-DON回收率的計(jì)算，發(fā)現(xiàn)用GC-MS法可以準(zhǔn)確可靠地定量高粱樣品中的DON含量。

2.3 液相色譜(LC)及液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)

LC-MS是一種集分離系統(tǒng)與檢測(cè)系統(tǒng)于一體的檢測(cè)手段，可同時(shí)定性定量分析，操作簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)、靈敏度高，在生化、藥物、食品保健分析和環(huán)境污染方面被廣泛應(yīng)用。LC-MS法是多種真菌毒素分析的首選技術(shù)[24]，Guo等[25]采用超高效液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法(UHPLC-MS)建立了一種簡(jiǎn)單可靠且能同時(shí)測(cè)定葡萄中鏈格孢酚(AOH)、交鏈格孢酚單甲醚(AME)、細(xì)交鏈格孢菌酮酸(TeA)和騰毒素(TEN)等幾種鏈格孢霉毒素的分析方法，通過(guò)測(cè)定線性(R2>0.99)、回收率(77.8%～101.6%)、靈敏度(檢測(cè)限0.03～0.21 μg/kg，定量限0.09～0.48 μg/kg)和精密度(RSD≤12.9%)進(jìn)行驗(yàn)證，表明所開發(fā)方法的準(zhǔn)確性、可重復(fù)性和敏感性是可接受的，成功揭示了葡萄中鏈格孢屬毒素的污染狀態(tài)。Yan等[26]結(jié)合QuEChER預(yù)處理，將LC-MS法應(yīng)用于同時(shí)定量不同豬組織(心臟、肝臟、脾臟和肌肉)中的9種真菌毒素，發(fā)現(xiàn)其目標(biāo)毒素檢出限為0.5～1.0 ng/g，定量限為1～2 ng/g，加標(biāo)組織回收率為70%～110%，重現(xiàn)性良好，驗(yàn)證結(jié)果表明LC-MS法結(jié)合QuEChERS樣品前處理方法是有效的，準(zhǔn)確可靠，重現(xiàn)性好，可滿足大量樣品的多組分同時(shí)檢測(cè)[27]。

3 免疫學(xué)快速檢測(cè)方法

3.1 酶聯(lián)免疫法(ELISA)

ELISA是一種將現(xiàn)代檢測(cè)手段與免疫技術(shù)相結(jié)合的微量檢測(cè)技術(shù)，其彌補(bǔ)了以往儀器法和化學(xué)法的一些缺陷，在食品、藥品等領(lǐng)域有較高應(yīng)用價(jià)值。Wang等[28]采用單克隆抗體13D8建立了間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(icELISA)，可同時(shí)檢測(cè)AOH和AME，其檢出限分別為0.7，1.0 ng/mL，添加小麥樣品的平均回收率為84.5%～107.6%，變異系數(shù)<10%，其檢測(cè)結(jié)果與LC-MS法一致，表明該方法適用于小麥中AOH和AME的同時(shí)檢測(cè)，但icELISA法有時(shí)會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，且不能用于多種毒素的同時(shí)檢測(cè)。

3.2 膠體金免疫層析法(GICA)

GICA法是一種以膠體金為示蹤劑，用于抗原抗體的檢測(cè)技術(shù)，其操作簡(jiǎn)便、成本低，適用于基層檢測(cè)[29]。Hu等[30]基于GICA快速篩選了藥材根和根莖中毒性最強(qiáng)的AFB1，樣品中的遷移分析物(AFB1)和固定在測(cè)試條上的抗原之間發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)，爭(zhēng)奪膠體金標(biāo)記的抗體結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)，此法達(dá)到了≤0.1 ng/mL的高靈敏度，且與LC-MS法測(cè)定結(jié)果一致。盡管中藥基質(zhì)復(fù)雜，但該方法具有較高的靈敏度和選擇性，且樣品處理簡(jiǎn)單，被證明是一種快速、經(jīng)濟(jì)、可靠的現(xiàn)場(chǎng)篩查富含淀粉和多糖的中草藥中真菌毒素的技術(shù)。付寧等[31]用GICA法測(cè)定了100批次中藥材中的AFB1含量，假陽(yáng)性率為20.8%，假陰性率為0，符合率為83.3%。為了降低篩查的假陽(yáng)性率，可以采取增強(qiáng)檢測(cè)信號(hào)的手段，提高準(zhǔn)確率和精確度，或者將此法與生物傳感器技術(shù)聯(lián)用以達(dá)到更為理想的效果。

3.3 時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)(TR-FIA)

TRFIA是一種集抗原抗體的特異性和示蹤劑靈敏性于一體的超微量技術(shù)，Hu等[32]建立了以Eu3+標(biāo)記的免疫球蛋白為示蹤劑定量檢測(cè)飼料中AFB1含量的TRFIA法，與ELISA法相比，該方法的變異系數(shù)為1.25%～3.73%，平均回收率為93.71%～97.80%，具有較高靈敏度和精密度，通過(guò)與HPLC比較，證實(shí)了該方法的可靠性，此外可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品，大大降低了工作人員的檢測(cè)強(qiáng)度，減小了人為誤差，提高了工作效率和準(zhǔn)確性，因而在安全檢測(cè)方面具有重要價(jià)值。

4 其他快速檢測(cè)方法

4.1 表面等離子體共振技術(shù)(SPR)

SPR技術(shù)可實(shí)時(shí)分析天然狀態(tài)下生物分子間相互作用，無(wú)需破壞生物分子，主要被應(yīng)用于醫(yī)療、藥物、食品檢測(cè)等方面。Wei等[33]建立了基于自組裝單層膜的SPR法，測(cè)得AFB1、赭曲霉毒素A(OTA)、DON的最低檢出限分別為0.59，1.27，3.26 ng/mL，所有真菌毒素的交叉反應(yīng)性較低。此外，將試驗(yàn)數(shù)據(jù)與LC-MS分析結(jié)果進(jìn)行比較，兩者吻合度較好，結(jié)果可靠，表明所建立的同時(shí)檢測(cè)多種真菌毒素的SPR方法靈敏度高、線性好、特異性強(qiáng)，能夠滿足谷物類食品的檢測(cè)要求，可實(shí)時(shí)分析以及免標(biāo)記，為真菌毒素檢測(cè)工作帶來(lái)了極大便捷[34]。

4.2 表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)(SERS)

SERS是一種有極強(qiáng)拉曼散射增強(qiáng)效應(yīng)的分子振動(dòng)光譜技術(shù)[35]，Rostami等[36]建立了基于多孔SERS檢測(cè)平臺(tái)實(shí)現(xiàn)OTA無(wú)標(biāo)記檢測(cè)的SERS法，可將支持液膜提取法與SERS法結(jié)合定量葡萄酒樣品中的OTA，其在白葡萄酒中檢測(cè)限為115 ng/mL，與LC-MS法定量相當(dāng)。但是紅葡萄酒中基質(zhì)效應(yīng)會(huì)干擾檢測(cè)，而支持液膜提取與SERS法結(jié)合為OTA檢測(cè)提供了一種有效減少時(shí)間和成本的方法，這是優(yōu)于其他提取和直接檢測(cè)方法的明顯優(yōu)勢(shì)。Li等[37]展示了一種基于微陣列SERS的小分子免疫傳感器的復(fù)用能力，可實(shí)現(xiàn)AFB1、ZEN、OTA 3種毒素的同時(shí)分析，其檢測(cè)范圍分別為0.061～0.066，0.530～0.570，0.260～0.290 μg/kg，回收率為83.8%～108.1%，變異系數(shù)<15%。通過(guò)與常規(guī)儀器分析進(jìn)行比較，二者所得結(jié)論一致，說(shuō)明該方法準(zhǔn)確可靠，具有較高靈敏度、高重現(xiàn)性、高穩(wěn)定性、寬檢測(cè)范圍，但目前僅限于實(shí)驗(yàn)室使用，無(wú)法實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)[38]，其在痕量檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用潛力有待進(jìn)一步開發(fā)[39]。

4.3 生物芯片技術(shù)(BcT)

BcT是一種快速微型分析技術(shù)，將生物大分子固化至載體表面，使二者緊密結(jié)合，根據(jù)分子間反應(yīng)，采用儀器快速分析信號(hào)完成檢測(cè)[40]，在營(yíng)養(yǎng)學(xué)、微生物學(xué)、毒理學(xué)與轉(zhuǎn)基因食品領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。王云霞等[41]采用該技術(shù)同時(shí)測(cè)定了OTA、DON、AFB1和ZEN在奶牛飼料中的殘留量，并與HPLC方法進(jìn)行結(jié)果比對(duì)，在1倍檢出限加標(biāo)回收試驗(yàn)和2倍檢出限加標(biāo)回收試驗(yàn)中，4種毒素回收率均為80%～120%，其準(zhǔn)確性良好，變異系數(shù)均≤15%，可滿足定量測(cè)定要求，并且前處理簡(jiǎn)便，檢測(cè)過(guò)程耗時(shí)短，適合大批量樣品的現(xiàn)場(chǎng)篩查工作。但是從生物芯片的應(yīng)用現(xiàn)狀來(lái)看，其還存在一些限制因素，如缺少規(guī)范化的標(biāo)準(zhǔn)、檢測(cè)靈敏度雖有提升但受到諸多條件影響、檢測(cè)系統(tǒng)昂貴以及需大量準(zhǔn)確的DNA片段信息等，這些問(wèn)題還有待進(jìn)一步研究[42]。

5 結(jié)束語(yǔ)

中國(guó)是人口大國(guó)，民以食為天，糧食污染問(wèn)題不容忽視，如何實(shí)現(xiàn)食品行業(yè)中真菌毒素準(zhǔn)確、靈敏、便捷高效檢測(cè)仍是未來(lái)食品安全檢測(cè)中的重點(diǎn)內(nèi)容與發(fā)展趨勢(shì)。傳統(tǒng)的薄層色譜法靈敏度低、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，無(wú)法滿足快速檢測(cè)的需要。氣相色譜法、氣相—質(zhì)譜聯(lián)用法、液相色譜法和液相—質(zhì)譜聯(lián)用法具有檢測(cè)限低、重現(xiàn)性好、回收率高等優(yōu)勢(shì)，但由于其操作繁瑣、檢測(cè)周期長(zhǎng)，故不適合應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。基于免疫學(xué)原理的酶聯(lián)免疫吸附法、膠體金免疫層析技術(shù)和時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)具有快速、靈敏、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，但也存在抗原抗體制備困難、有底物干擾、假陽(yáng)性多等缺點(diǎn)。一些新興的檢測(cè)方法如表面等離子體共振技術(shù)、表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)和生物芯片技術(shù)等在毒素的快速檢測(cè)方面也得到了一定發(fā)展，但由于缺少規(guī)范化的標(biāo)準(zhǔn)，將其推廣使用仍需進(jìn)一步的研究。