王成梅 徐進

摘要：本文對雞骨素中硝基呋喃代謝物殘留量的液相色譜-質(zhì)譜進行了不確定度的評定。本文參照《測量不確定度的評定與表示》相關(guān)理論，建立對應(yīng)的數(shù)學(xué)模型，對雞骨素中硝基呋喃代謝物殘留量的不確定度進行來源分析和計算。本文認為不確定度的來源主要有以下幾個方面：標品的純度;配制的過程;稱樣量;重復(fù)測定次數(shù);加標回收率等方面。當添加濃度在1.0μg/kg的水平下，四種硝基呋喃代謝物的不確定度分別為：硝基呋喃西林代謝物CSEM=0.981μg/kg，U=0.070μg/kg，k=2;呋喃唑酮代謝物CAOZ=1.032μg/kg，U=0.061μg/kg，k=2;呋喃它酮代謝物CAMOZ=1.068μg/kg，U=0.076μg/kg，k=2;呋喃妥因代謝物CAHD=1.007μg/kg，U=0.046μg/kg，k=2。本試驗研究結(jié)果對于實際操作過程中減少不確定度，提高數(shù)據(jù)準確性和可靠性具有重要的意義。

關(guān)鍵詞：液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;雞骨素;硝基呋喃代謝物;不確定度

硝基呋喃類藥物是一種廣譜性抗菌藥物，具有價格低廉、殺菌效果強等優(yōu)點。硝基呋喃類藥物在體內(nèi)的代謝物易與體內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)合形成穩(wěn)定的化合物。該化合物在體內(nèi)貯留時間久，能誘發(fā)基因突變，具有高制畸、致癌、致突變等危害[1-3]。因此硝基呋喃它酮、硝基呋喃唑酮、硝基呋喃妥因和硝基呋喃西林列入違禁獸藥，要求所有食品動物中不得檢出。目前對于硝基呋喃代謝物的檢測方法中高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜是幾種檢測方法中精密度最高、數(shù)據(jù)最準確的一種方法。

測量不確定度是一種表示測量值分散性的重要參數(shù)[4]，是評定結(jié)果和水平的重要指標。GB/T 27025-2008中明確規(guī)定要具有不確定度或評定不確定度的程序[5]。隨著檢測能力和檢測數(shù)據(jù)準確性的逐漸提高，資質(zhì)認定過程中不確定度已經(jīng)成為檢測過程中必須完成的一項工作。不確定度的研究對于檢測結(jié)果的準確性判定具有重要的意義。本文通過對雞骨素中硝基呋喃代謝物殘留量的內(nèi)標法進行不確定度分析，找出影響因素，從而保證數(shù)據(jù)的準確性，提高檢測數(shù)據(jù)的質(zhì)量。

1 材料和設(shè)備

儀器與設(shè)備

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（1260-6460，美國Agilent公司）;水浴恒溫振蕩器;MS3 Digital渦旋振蕩器（德國IKA公司）電子天平和高精密電子天平;高速冷凍離心機;純水機;pH計;5mL、1mL和100μL移液槍;

試劑與材料

呋喃西林代謝物鹽酸鹽（簡稱：SEM.HCL，下同）純度99.8%，德國Dr公司;呋喃妥因代謝物鹽酸鹽（簡稱：AHD.HCL，下同）純度99.3%，德國Dr公司;呋喃唑酮代謝物AOZ純度99.3%，德國Dr公司;呋喃它酮代謝物（簡稱：AMOZ，下同）純度99.6%，德國Dr公司;呋喃西林代謝物同位素標準品SEM-13C-15N2，WITEGA公司;呋喃妥因代謝物同位素標準品AHD-13C3，WITEGA公司;呋喃唑酮代謝物氘代物AOZ-D4純度，德國Dr公司;呋喃它酮代謝物氘代物AMOZ-D5純度，德國Dr公司;甲醇、乙腈、乙酸乙酯、正己烷、甲酸、鄰硝基苯甲醛為色譜純，購自Fisher Scientific公司;濃鹽酸、氫氧化鈉、乙酸銨、磷酸氫二鉀均為分析純，購自上海國藥集團;實驗用水為超純水。

實驗用樣品來自天博食品配料有限公司。

方法

標準溶液的配制

標準儲備溶液：分別準確稱取AOZ 10.06mg、SEM·HCL 14.9mg、AMOZ 10.04mg、AHD·HCL 13.26mg，AOZ-D4 10.0mg、SEM-13C-15N2 10.0mg、AMOZ-13C3 10.04mg、AHD-13C3 10.0mg，乙腈溶解配置成1.0mg/mL標準儲備液。

混合標準儲備液：1mL的移液槍各移取1.0mL 標準儲備液于10mL容量瓶中，用乙腈定容。用同樣的方法進行稀釋最終得10.0Ug/L混合標準溶液。

混合內(nèi)標工作溶液：按照上述方法進行同樣的稀釋配置成10.0μg/L內(nèi)標混合工作液。

混合標準溶液的制備：分別移取10.0Ug/L的混合標準工作液50、100μL和準確吸取100.0Ug/L混合標準溶液20、50、100μL至5個50mL離心管中，分別加入20μL混合內(nèi)標工作溶液，按照前處理步驟分別制成0.50、1.0、2.0、5.0、10.0μg/L的標準曲線，上機待測。

前處理

稱取樣品2.000g于研缽中，加入2.5-4g的硅藻土進行細細研磨。樣品研磨后轉(zhuǎn)移至離心管中，加入內(nèi)標20μL，通過回收把控質(zhì)量，再加入0.2mol/L鹽酸10mL和鄰硝基苯甲醛（稱取鄰硝基苯甲醛0.015g，甲醇定容1mL，100?L對應(yīng)一個樣品）。11500r/min均質(zhì)1min，37℃恒溫振蕩器中避光衍生16h。取出冷卻至室溫，加入磷酸氫二鉀和氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7.5左右。加入5mL的乙酸乙酯，振蕩20min，9000r/min離心5min。上清液轉(zhuǎn)移至10mL離心管中，重復(fù)提取兩次，合并提取液。40℃氮吹近干，加1mL0.1%甲酸溶液，加入2mL正己烷除油，渦旋2min，5000r/min離心5min，取下層液過0.22Um水系膜過濾，上進待測。

1.3.3 測量不確定度來源

不確定度來源主要來自以下幾個方面：標品的純度（含內(nèi)標和外標）;標準溶液配制過程;混合標準溶液的配制;稱樣量;重復(fù)測量;復(fù)現(xiàn)性限R等。

2 不確定度評定

2.1 數(shù)學(xué)模型的建立

本實驗按照下式（1）計算雞骨素中硝基呋喃代謝物的殘留量：

式中R表示樣液中分析物與內(nèi)標物峰面積的比值;c代表混合基質(zhì)標準溶液中分析物的濃度（ng/mL）;V為樣液最終定容體積單位為毫升（mL）;RS表示混合基質(zhì)標準溶液中分析物與內(nèi)標物峰面積的比值;m代表試樣質(zhì)量（g）。

2.2 合成不確定度公式如下式：

Urel（1）：標準品純度引入的不確定度;

Urel（2）：內(nèi)標標準品純度引入的不確定度;

Urel（3）：標準溶液配制引入的不確定度;

Urel（4）：內(nèi)標標準溶液配制引入的不確定度;

Urel（5）：稱樣量引入的不確定度;

Urel（6）：重復(fù)線性回收引入的不確定度;

urel（7）：加標回收率引入的不確定度

2.3不確定度的分量計算

2.3.1 標準品純度的不確定度

SEM·HC擴展不確定度U=0.92%，由于擴展不確定度是是標準不確定度的k倍，包含因子k=2，故其純度引入的標準不確定度為：

Urel（SEM·HCL）=U/k=0.92%/2=0.0046

AMOZ擴展不確定度U=3.73%，包含因子k=2，其引入的標準不確定度為：

Urel（AMOZ）=U/k=3.73%/2=0.01865

AOZ擴展不確定度U=1.73%，包含因子k=2，其引入的標準不確定度為：

Urel（AOZ）=U/k=1.73%/2=0.00865

AHD擴展不確定度U=2.99%，包含因子k=2，其引入的標準不確定度為：

Urel（AHD）=U/k=2.99%/2=0.01495

2.3.2 內(nèi)標純度引入的不確定度

AOZ-D4擴展不確定度U=1.95%，包含因子k=2，其引入的標準不確定度為：

Urel（AOZ-D4）=U/k=1.95%/2=0.00975

AMOZ-D5擴展不確定度U=1.15%，包含因子k=2，其引入的標準不確定度為：

Urel（AMOZ-D5）=U/k=1.15%/2=0.00575

AHD-13C3純度為（99.8±0.2）%，其引入的標準不確定度為：

Urel（AHD-13C3）=?=0.00116

SEM-13C-5N2純度為（99.98±0.2）%，其引入的標準不確定度為：

Urel（SEM-13C-5N2）=?=0.00116

2.3.3標準溶液配制引入的不確定度

2.3.3.1 標準物質(zhì)稱量引入的不確定度

標準物質(zhì)稱量不確定度來自三個方面：a，稱量的重復(fù)性，可以通過10次重復(fù)稱量，用UA（m1）表示;b，來自天平稱量不準造成的不確定度;c，天平標度的可讀性（數(shù)字分辨力）引入的不確定度。

a.對標品進行10次重復(fù)測量（注：稱樣量和實際稱量盡可能一致），采用貝塞爾公式計算其標準偏差，標準不確定度等于1倍的標準偏差：

b.電子天平的最大允許誤差為±0.03mg，區(qū)間半寬度a1（m1）=0.03mg，該分布屬于均勻分布，包含因子k1（m1）= .其標準不確定度為：

c.天平分辨力引入的標準不確定度分量UB2（m1）=0.005mg，k2（m1）= 。其標準不確定度為：

合成不確定度為：

由此可得出各化合物的標準不確定度分別為：

Urel（SEM·HCL）=0.0339mg/14.9mg=0.002275

Urel（AMOZ）=0.0339mg/10.04mg=0.003376

Urel（AOZ）=0.0339mg/10.06mg=0.003370

Urel（AHD·HCL）=0.0339mg/13.26mg=0.002557

2.3.3.2 定容體積引入的不確定度

定容體積不確定來源于三個方面：第一，重復(fù)性UA（V）;第二，容量瓶允差UB1（V）;溫度系數(shù)UB2（V）。

本實驗通過對100mL的容量瓶定容10次，采用貝塞爾公式計算偏差，標準不確定度等于一倍的標準偏差：

標準儲備液采用乙腈溶解，定容至100mL容量瓶中，配制成相應(yīng)的濃度。容量瓶的檢定規(guī)程《JJG196-2006 常用玻璃量具》規(guī)定100mL的容量瓶屬于A級容量瓶。其所允許的偏差為±0.10。區(qū)間半寬度a1（V）=0.10。服從三角分布，包含因子k1（V）= 。其標準不確定UB1（V）為：

根據(jù)規(guī)程，容量瓶的檢定是在20℃條件下進行的。而液體的體積膨脹系數(shù)遠大于玻璃，因此實驗過程中只需要考慮液體的體積產(chǎn)生的膨脹系數(shù)。乙腈的體積膨脹系數(shù)為1.37×10-3/℃，產(chǎn)生的體積變化為±（100×4×1.37×10-3）=±0.548mL

則區(qū)間半寬度a2（V）=0.548mL，設(shè)為區(qū)間分布，包含因子k2=，則標準不確定度為：

則合成不確定度為：

其相對標準不確定度為：

2.3.3.3 標準溶液稀釋引入的不確定度

混合中間溶液采取逐級稀釋的操作，從1.0mg/mL稀釋到10.0μg/L。稀釋過程采用10mL的容量瓶和1000μL的移液槍。10mL的容量瓶最大允許誤差為±0.020mL，1000μL的移液槍的最大允許誤差為±1.0%，按照均勻分布，k=，則不確定度為：

2.4 內(nèi)標標準溶液配制引入的不確定度

如2.3.3 內(nèi)標溶液配制過程中稱樣量引入的不確定度分別為：

Urel（SEM-13C-15N2）=0.0339mg/10.0mg=0.00339

Urel（AMOZ-13C3）=0.0339mg/10.04mg=0.003376

Urel（AHD-13C3）=0.0339mg/10.0mg=0.00339

Urel（AOZ-D4）=0.0339mg/10.0mg=0.00339

定容體積和稀釋過程引入的不確定度如2.3.3.2和2.3.3.3一樣。

2.5樣品稱量引入的不確定度

天平分辨力為0.1mg，區(qū)間半寬度a2=0.05mg，k3=，樣品的稱樣量為2.00g。其標準不確定度為：

2.6 重復(fù)測量引入不確定度

對某一濃度進行重復(fù)測量10次，根據(jù)貝塞爾公式進行計算，計算公式如下;計算結(jié)果見表1

標準不確定度公式：

2.7 加標回收率引入的相對不確定度

對樣品進行加標回收試驗，在2μg/kg水平下進行6次加標回收實驗，用如下公式進行計算。加標回收不確定度服從均勻分布，k=，計算結(jié)果見下表：

2.8 合成相對標準不確定度及不確定度

以上各項不確定度相互獨立，不考慮分量之間的相關(guān)性，則合成不確定度urel（c）按照公式（2）計算和不確定度uc（X）檢測結(jié)果見下表。

95%置信概率其包含因子k=2，擴展不確定度U=k*uc（X），根據(jù)計算結(jié)果為：硝基呋喃西林代謝物CSEM=0.981μg/kg，U=0.070μg/kg，k=2;呋喃唑酮代謝物CAOZ=1.032μg/kg，U=0.061μg/kg，k=2;呋喃它酮代謝物CAMOZ=1.068μg/kg，U=0.076μg/kg，k=2;呋喃妥因代謝物CAHD=1.007μg/kg，U=0.046μg/kg，k=2。

3 結(jié)論

根據(jù)測量不確定度評定方法，本實驗對雞骨素中硝基呋喃代謝物不確定度來源進行分析，通過建立數(shù)學(xué)模型，評定和計算各不確定度分量。結(jié)果表明，雞骨素中硝基呋喃代謝物殘留量測定的不確定度主要來源于標準品純度、配制過程、樣品稱樣量、重復(fù)測量、樣品加標回收等方面。因此在日常的檢測中應(yīng)盡量選用純度較高的標品，在配制的過程中選用精密度高的玻璃量器或者移液器、天平等。同時在測定的過程中盡量做到多次測量以減少檢測過程中產(chǎn)生的不確定度，從而提高檢測的準確度。

參考文獻

[1]王群，馬兵，呂海燕，等. 食品中硝基呋喃類及其代謝物對人體健康的安全性評價[J]. 中國漁業(yè)質(zhì)量與標準，2013，3（2）：4 -10.

[2]蔣原，丁濤，徐錦忠. 硝基呋喃類藥物在克氏鰲蝦組織中消除規(guī)律的研究[J]. 畜牧與獸醫(yī)，2008，40（2）：34-37.

[3]Hoogenboom L A，van Bruchem G D，et al. Absorption of amutagenic metabolite released from protein - bound resi-dues of furazolidone[J]. Environ Toxicol Pharmacol，2002，11（3）： 273 -287.

[4]Cordero R，Seckmeyer G，Pissulla D，et al. Uncertainty evaluation of the spectral UV irradiance evaluated by u-sing the UVSPEC radiative transfer model[J]. Opt Com-mun，2007，276（12）： 44 -53.

[5]全國認證認可標準化技術(shù)委員會. GB/T 27025—2008：檢測和校準實驗室能力的通用要求[S]. 北京：中國標準出版社，2008.

作者簡介：王成梅（1984.12）女，漢族，山東省濟寧市，中級工程師，研究生（碩士），研究方向：食品檢測與安全 .

徐進（1988.7） 女 漢族 山東省濟寧市，助理工程師，本科 ，研究方向：食品檢測與樣品管理.