劉嘉榆，鄭夢(mèng)琪，陳 菡，李斌斌，湯 維，章國(guó)衛(wèi)

(杭州師范大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 311121)

血友病是X性聯(lián)隱性遺傳病，是由于凝血因子缺失而導(dǎo)致的凝血障礙。血友病A患者缺失凝血因子VIII(FVIII)，F(xiàn)VIII基因較大(180 kb)且其蛋白結(jié)構(gòu)復(fù)雜，血友病B患者缺失凝血因子IX(FIX)，F(xiàn)IX基因相對(duì)較小(34 kb)且其蛋白結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單?；蚣暗鞍捉Y(jié)構(gòu)的不同導(dǎo)致血友病A和血友病B在疾病的發(fā)生、特點(diǎn)以及產(chǎn)生的抑制物的危險(xiǎn)程度上都有區(qū)別。血友病A患者占血友病患者總數(shù)的85%，血友病A重度患者的比例(45%)高于血友病B(35%)，血友病A患者產(chǎn)生中和抗體的比例高于血友病B患者[1]。

隨著基因與載體研究的突破，血友病的基因治療獲得了較大的發(fā)展。維持長(zhǎng)期高濃度的凝血因子表達(dá)是血友病基因治療的主要問(wèn)題，通過(guò)改造凝血因子編碼基因以增加基因表達(dá)效率或增強(qiáng)凝血因子活性成為提高基因治療效果的一個(gè)重要途徑。應(yīng)用于基因治療的病毒載體主要包括腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體(AAV)、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和慢病毒載體(LV)，血友病基因治療主要集中于使用腺相關(guān)病毒載體和慢病毒載體。同時(shí)，基因組編輯工具(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins, CRISPR/Cas9)的發(fā)展也為基因治療提供了新的手段。本文圍繞治療基因、載體和靶細(xì)胞，總結(jié)血友病基因治療的研究進(jìn)展，對(duì)血友病基因治療的優(yōu)勢(shì)和風(fēng)險(xiǎn)做綜合性分析。

1 治療基因

1.1 FIX基因 高凝血活性FIX突變體FIX-R338L的發(fā)現(xiàn)為血友病B的基因治療提供了新途徑。FIX-R338L發(fā)現(xiàn)于一名易栓癥病人，是自然發(fā)生的單氨基酸替換的FIX突變體，F(xiàn)IX的338位的精氨酸被亮氨酸替代，導(dǎo)致FIX的催化結(jié)構(gòu)域發(fā)生改變，使其在維持相同蛋白表達(dá)水平的情況下活性增加到野生型FIX的5～10倍[2]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)利用病毒裝載的FIX-R338L進(jìn)行血友病B的基因治療可以在降低載體濃度的情況下仍顯著提高FIX活性及其治療效果，從而可降低載體蛋白在血漿中的暴露量，減輕由于載體蛋白而引起的肝臟損傷和免疫反應(yīng)。2015年，Spark公司報(bào)道了以FIX-R338L進(jìn)行I/II期臨床試驗(yàn)的結(jié)果，以腺相關(guān)病毒(AAV)包裝的FIX-R338L(SPK-9001)對(duì)10個(gè)血友病B病人進(jìn)行注射，注射劑量為5×1011mg/kg。52周的持續(xù)監(jiān)測(cè)中，F(xiàn)IX平均活性為正常的(33.7±18.5)%，9人在治療后沒(méi)有發(fā)生出血事件，8人完全停止了FIX的輸注[3]。Nathwani等[4]以正常FIX進(jìn)行的基因治療臨床試驗(yàn)中，AAV病毒劑量為2×1012vg/kg，F(xiàn)IX的最高活性為12%。病毒劑量下降一個(gè)數(shù)量級(jí)，F(xiàn)IX-R338L可使FIX活性增加，證明該突變體具有較大的臨床應(yīng)用前景，為血友病的治療研究提供了一個(gè)新的方向。

1.2 FVIII基因 過(guò)大的基因長(zhǎng)度和復(fù)雜的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)增加包裝和表達(dá)FVIII的難度，密碼子優(yōu)化可提高FVIII的表達(dá)水平。FVIII的結(jié)構(gòu)域包括A1-A2-B-A3-C1-C2，刪除B結(jié)構(gòu)域可減少FVIII基因的長(zhǎng)度且不影響其活性，使FVIII基因可被病毒載體包裝而應(yīng)用于基因治療。BioMarin公司使用經(jīng)密碼子優(yōu)化的B結(jié)構(gòu)域缺失的人FVIII基因(FVIII-BDD)，以AAV5病毒作為基因載體開(kāi)展了一項(xiàng)血友病A的I/II期臨床研究[5]，高劑量組的所有7名患者治療后血漿FVIII活性都超過(guò)5%，其中6名患者一年內(nèi)FVIII水平均維持在50%～150%；所有患者都停止了預(yù)防性治療所需的FVIII注射，出血事件從治療前的每年16次下降到1次，患者中未發(fā)現(xiàn)FVIII抑制物的產(chǎn)生。Miao等[6]發(fā)現(xiàn)，與完全刪除B結(jié)構(gòu)域的FVIII相比，保留B結(jié)構(gòu)域中N端的226個(gè)氨基酸及其6個(gè)天冬氨酸殘基上連接的N-糖基部分能使FVIII的分泌增加10倍；如果同時(shí)將A1結(jié)構(gòu)域中309位的苯丙氨酸突變?yōu)榻z氨酸可進(jìn)一步增加FVIII的分泌。McIntosh等[7]用包含了6個(gè)糖基化位點(diǎn)的17個(gè)氨基酸殘基的多肽序列代替226個(gè)氨基酸殘基的間隔序列進(jìn)一步縮短了FVIII基因的長(zhǎng)度，使FVIII的表達(dá)水平增加了2倍；結(jié)合高效的肝特異性啟動(dòng)子形成的表達(dá)框架可更高效地包裝進(jìn)AAV載體中，在小鼠和猴血友病A模型中形成更高的FVIII表達(dá)水平。

Siner等[8]模仿狗FVIII-BDD，將人FVIII-BDD Furin識(shí)別序列處的精氨酸突變成組氨酸(hFVIII-R1645H)后，可使單鏈形式的人FVIII-BDD分泌增加到原來(lái)的2倍；同時(shí)刪除Furin識(shí)別位點(diǎn)使FVIII以單鏈形式合成，在體內(nèi)和體外試驗(yàn)中都可增加FVIII的分泌[9]。也有研究[10]指出，將位于A1結(jié)構(gòu)域第309位的苯丙氨酸突變?yōu)榻z氨酸可增加FVIII的分泌。

Doering等[11]在A1和A3結(jié)構(gòu)域引入豬FVIII序列構(gòu)建了人/豬雜交FVIII表達(dá)序列，該表達(dá)序列可產(chǎn)生高達(dá)人FVIII 10倍的表達(dá)量。近期，該團(tuán)隊(duì)通過(guò)分子進(jìn)化學(xué)手段對(duì)不同動(dòng)物中的FVIII進(jìn)行序列比對(duì)，利用祖先序列重建(ancestral sequence reconstruction，ASR)技術(shù)獲得與人FVIII具有95%同源性的表達(dá)能力更強(qiáng)的FVIII表達(dá)序列，其FVIII表達(dá)水平在血友病A小鼠中顯著增加[12]。

2 載體

2.1 腺相關(guān)病毒載體 AAV是一種無(wú)包膜、單鏈DNA病毒，具有低免疫原性、長(zhǎng)期轉(zhuǎn)基因表達(dá)能力、基本不與宿主染色體整合的特性。Nathwani等[4]首次用AAV8介導(dǎo)血友病B基因治療臨床試驗(yàn)，實(shí)現(xiàn)了長(zhǎng)期的基因表達(dá)。后續(xù)，Spark公司以AAV包裝FIX-R338L[3]，BioMarin公司以AAV5包裝FVIII基因[5]成功進(jìn)行了血友病的基因治療臨床試驗(yàn)。

但AAV基因治療還面臨著許多問(wèn)題，首先，AAV的基因容量只有5 kb左右，需精確設(shè)計(jì)FVIII編碼序列、優(yōu)化啟動(dòng)子及其他必須序列的長(zhǎng)度，才可保證FVIII的表達(dá)水平。其次，由于AAV中和抗體在人群中廣泛存在，現(xiàn)有的AAV基因治療只對(duì)不含或含很少抗AAV中和抗體的血友病患者適用。此外，AAV基因組是非整合的，存在治療基因缺失和在兒童體內(nèi)基因被稀釋的可能性?？笰AV中和抗體在首次治療之后會(huì)產(chǎn)生，通過(guò)清除血漿抗體或免疫抑制可達(dá)到對(duì)產(chǎn)生抗體患者進(jìn)行治療的目的，但其副作用仍然是需要考慮的問(wèn)題[13]。從病毒的角度來(lái)看，更換不同血清型AAV可以成為解決這一問(wèn)題的一個(gè)方法。Majowicz等[14]在小鼠和非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物中證實(shí)在富含AAV5中和抗體的動(dòng)物中注射AAV1可實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)移基因的表達(dá)。通過(guò)改變病毒衣殼蛋白的抗原表位以避免中和抗體的識(shí)別也是可采取的一項(xiàng)策略。Tse等[15]運(yùn)用分子進(jìn)化學(xué)手段分析AAV抗原表位的保守區(qū)域并進(jìn)行突變篩選，獲得新的AAV突變體，可逃避已有AAV中和抗體的攻擊，但仍會(huì)在注射后誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的中和抗體，從而難以應(yīng)用于二次注射。

2.2 慢病毒載體 作為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，LV可運(yùn)載相對(duì)較大的基因片段，實(shí)現(xiàn)目的基因穩(wěn)定整合到靶細(xì)胞基因組。LV目前被開(kāi)發(fā)用于離體基因治療[16-22]和體內(nèi)基因治療[23]。運(yùn)用離體基因治療策略，通過(guò)LV將FVIII或FIX基因?qū)朐煅杉?xì)胞中，結(jié)合使用不同的特異啟動(dòng)子，可實(shí)現(xiàn)FVIII和FIX在血小板中儲(chǔ)存并發(fā)揮治療作用，或使表達(dá)的FVIII或FIX分泌入血漿發(fā)揮治療作用[11,24]。LV也可轉(zhuǎn)導(dǎo)外向生長(zhǎng)內(nèi)皮細(xì)胞或B細(xì)胞，經(jīng)移植后在體內(nèi)表達(dá)凝血因子[25-26]。體內(nèi)基因治療策略中采用靜脈直接注射LV易觸發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)而使LV失活。在小鼠和狗的血友病B模型中，在LV載體中引入抗原遞呈細(xì)胞特異表達(dá)的microRNA142以抑制治療基因在細(xì)胞中的表達(dá)，可大大降低免疫反應(yīng)的發(fā)生；通過(guò)靜脈注射使LV能穩(wěn)定地將目的基因轉(zhuǎn)移到肝臟，選擇肝細(xì)胞特異性的啟動(dòng)子可使轉(zhuǎn)基因表達(dá)嚴(yán)格限定于肝細(xì)胞[27]。Staber等[28]在用貓免疫缺陷病毒構(gòu)建的LV中引入桿狀病毒GP64包膜蛋白，使LV具備肝細(xì)胞的靶向性；在血友病A小鼠中靜脈注射該病毒實(shí)現(xiàn)了FVIII的表達(dá)與治療。Miao等[29]通過(guò)骨內(nèi)注射LV成功轉(zhuǎn)導(dǎo)了骨髓造血干細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)FVIII在血小板中的表達(dá)。

2.3 CRISPR/Cas9 在小向?qū)NA(small guide RNA, sgRNA)的指引下，Cas9蛋白與DNA靶序列鄰近原始間隔區(qū)相鄰基序(PAM)的特定位點(diǎn)相互作用并引起DNA雙鏈斷裂(DSB)。 DSB的產(chǎn)生可誘導(dǎo)兩種DNA修復(fù)途徑：同源重組修復(fù)(HDR)和非同源末端連接重組修復(fù)(NHEJ)。利用這兩種修復(fù)途徑可實(shí)現(xiàn)基因組編輯的目的并應(yīng)用于基因治療中。CRISPR/Cas9需通過(guò)不同的方式導(dǎo)入細(xì)胞才能發(fā)揮作用，病毒載體仍然是高效率的選擇。在血友病B小鼠中，以腺病毒為載體的CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因?qū)氡蛔C明能實(shí)現(xiàn)FIX基因的矯正，恢復(fù)小鼠凝血功能。但由腺病毒引發(fā)的免疫反應(yīng)及肝臟毒性仍然是影響治療效果的一個(gè)重要問(wèn)題[30]。相比腺病毒，AAV具有更低的機(jī)體免疫反應(yīng)和肝臟毒性。通過(guò)AAV介導(dǎo)也可成功地實(shí)現(xiàn)FIX基因編輯與修復(fù)[31]。CRISPR/Cas9在基因治療中的臨床應(yīng)用仍需解決由于脫靶效應(yīng)而造成的基因突變的風(fēng)險(xiǎn)以及Cas9蛋白過(guò)大不易包裝入AAV等問(wèn)題。

3 靶細(xì)胞

3.1 肝細(xì)胞 肝臟是凝血因子的主要合成部位，是血友病基因治療的主要靶細(xì)胞。已公開(kāi)報(bào)道的成功的血友病基因治療臨床試驗(yàn)都采用了以肝細(xì)胞作為靶細(xì)胞，以AAV作為載體的體內(nèi)基因治療策略[3-5]。利用LV進(jìn)行靶向肝細(xì)胞的基因治療在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中觀察到了治療效果[27]。Barzel等[32]利用AAV為載體，采用同源重組策略成功地將FIX基因插入到了小鼠肝細(xì)胞基因組清蛋白基因后，利用清蛋白的啟動(dòng)子表達(dá)了FIX，該策略不額外導(dǎo)入外源啟動(dòng)子增加了基因治療的安全性。由于FIX治療基因整合到小鼠基因組中可以長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)，有研究者嘗試運(yùn)用基因組編輯技術(shù)對(duì)肝細(xì)胞進(jìn)行基因矯正以達(dá)到治療目的[33]。直接注射病毒載體較易引起機(jī)體的免疫反應(yīng)及對(duì)肝臟的毒性作用，且不適于治療產(chǎn)生抑制物的患者。但也有證據(jù)表明靶向肝細(xì)胞的基因治療具有免疫耐受性，甚至可清除已存在的抑制物[34]。

3.2 造血干細(xì)胞及多種血細(xì)胞 造血干細(xì)胞的自我更新和分化能力能為患者持續(xù)提供血細(xì)胞。利用整合載體可實(shí)現(xiàn)目的基因在造血干細(xì)胞基因組中的穩(wěn)定整合，使治療基因在造血干細(xì)胞分化的后代中持續(xù)表達(dá)。利用組織特異性的啟動(dòng)子可實(shí)現(xiàn)治療基因在不同分化細(xì)胞中的特異表達(dá)，如使用珠蛋白啟動(dòng)子可使FIX在紅細(xì)胞中表達(dá)[35]，使用CD68啟動(dòng)子可使FVIII在單核細(xì)胞中表達(dá)[11]，兩者都可在血漿中恢復(fù)相應(yīng)的凝血因子活性，起到促進(jìn)凝血的治療作用。使用血小板特異的啟動(dòng)子可使FIX和FVIII在血小板中表達(dá)并儲(chǔ)存[36-37]，該基因治療策略的特點(diǎn)是將凝血因子局限在血小板中，只有血小板在出血部位被激活時(shí)才釋放出來(lái)促進(jìn)凝血，可提高出血部位的凝血因子局部濃度；由于血小板的隔離作用，血小板FVIII可在抑制物存在的情況下仍發(fā)揮促凝血作用，這項(xiàng)策略有可能成為針對(duì)已產(chǎn)生抑制物的血友病A患者的基因治療方法。此外，通過(guò)LV直接轉(zhuǎn)導(dǎo)B細(xì)胞也可實(shí)現(xiàn)FIX在B細(xì)胞中的表達(dá)[26]。

4 結(jié)論

血友病的基因治療在不斷探索中走向成熟，以AAV作為載體的靶向肝臟的基因治療臨床研究展現(xiàn)出極大的應(yīng)用前景。功能增強(qiáng)的FIX基因突變體FIX-R338L在增強(qiáng)血友病B的基因治療效果方面展現(xiàn)出功效。通過(guò)改進(jìn)FVIII表達(dá)框架可提高FVIII表達(dá)效率，進(jìn)一步提高FVIII的表達(dá)與活性是使血友病A基因治療最終獲得臨床應(yīng)用的關(guān)鍵；是否可獲得類似FIX-R338L的高活性FVIII突變體仍有待進(jìn)一步的研究。LV和造血干細(xì)胞結(jié)合的離體基因治療模式可能成為血友病基因治療的一條重要途徑。靶向血小板表達(dá)的FVIII在抑制物存在下仍能起到治療作用，是針對(duì)抑制物設(shè)計(jì)的基因治療策略。基因編輯等新技術(shù)的應(yīng)用也可為血友病的基因治療開(kāi)辟新的途徑。