黃燕鳳 翟 露 劉玉花 馬 翠 戴 霞

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院護(hù)理部，南寧市 530021，電子郵箱：1319376554@qq.com)

糖尿病是以血糖升高為特征的代謝性疾病，其可引起血管內(nèi)皮損傷和功能異常，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，導(dǎo)致冠心病、缺血性腦卒中及下肢動(dòng)脈閉塞等的發(fā)生，并發(fā)癥的發(fā)生是糖尿病患者致死致殘的主要原因[1-2]。而這種血管內(nèi)皮功能障礙的發(fā)生與內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells,EPCs)密切相關(guān)[3]。EPCs是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，在生理或病理因素刺激下，EPCs可從骨髓向靶部位動(dòng)員、歸巢及分化，參與血管新生及損傷血管的再內(nèi)皮化[4]。然而，糖尿病發(fā)生時(shí)機(jī)體EPCs數(shù)量減少、功能受損，不能有效地發(fā)揮內(nèi)皮修復(fù)作用[5-6]。因此，探尋改善糖尿病狀態(tài)下EPCs血管生成功能的方法及其相關(guān)機(jī)制，對(duì)治療糖尿病血管病變有重要意義。

有研究表明，有氧運(yùn)動(dòng)能提高中老年大鼠的EPCs增殖功能，促進(jìn)損傷血管內(nèi)皮的修復(fù)[7]。但目前關(guān)于運(yùn)動(dòng)影響糖尿病患者或者動(dòng)物模型EPCs功能作用的研究較少，尚未發(fā)現(xiàn)有研究報(bào)告聯(lián)合抗阻-有氧運(yùn)動(dòng)(簡(jiǎn)稱(chēng)聯(lián)合運(yùn)動(dòng))對(duì)2型糖尿病患者EPCs功能的影響，其相關(guān)機(jī)制尚不十分明確。有學(xué)者報(bào)告，磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)信號(hào)通路參與血管修復(fù)和生成過(guò)程，激活PI3K/AKT信號(hào)通路可以改善糖尿病小鼠EPCs血管生成能力[8]。聯(lián)合運(yùn)動(dòng)是否能通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/AKT的表達(dá)水平，進(jìn)而改善EPCs的血管生成功能有待進(jìn)一步研究。本研究對(duì)2型糖尿病小鼠實(shí)施為期8周的聯(lián)合運(yùn)動(dòng)干預(yù)，體外分離培養(yǎng)骨髓源EPCs，探討聯(lián)合運(yùn)動(dòng)對(duì)EPCs血管再生功能的影響及其相關(guān)機(jī)制，為運(yùn)動(dòng)治療糖尿病、防治糖尿病血管并發(fā)癥提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物及分組 選擇20只2型糖尿病db/db小鼠[品系名稱(chēng)：BKS-DB/Nju；購(gòu)自南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院，許可證號(hào)：SYXK(蘇)2016-0012]，8周齡，均為雄性，平均血糖為28 mmol/L，平均體重為42 g。按照隨機(jī)數(shù)字表法，將小鼠分為聯(lián)合運(yùn)動(dòng)組和空白組，每組10只。

1.2 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練 空白組小鼠不進(jìn)行任何運(yùn)動(dòng)干預(yù)。聯(lián)合運(yùn)動(dòng)組采取有氧運(yùn)動(dòng)與抗阻運(yùn)動(dòng)相交替的訓(xùn)練方式，每周運(yùn)動(dòng)6 d，即周一、三、五進(jìn)行抗阻運(yùn)動(dòng)，周二、四、六進(jìn)行有氧運(yùn)動(dòng)，共8周。其中，抗阻運(yùn)動(dòng)為在小鼠的尾部纏繞一定重量的水球促其進(jìn)行爬梯訓(xùn)練，具體干預(yù)方案見(jiàn)表1；有氧運(yùn)動(dòng)為小鼠在坡度均為0度的8跑道小鼠跑臺(tái)(北京東西儀器科技有限公司，型號(hào)：WDW-1)上跑步，第1周時(shí)有氧運(yùn)動(dòng)速度為10 m/min，30 min/d，逐漸增加至15 m/min，30 min/d，第2～8周速度為15 m/min，60 min/d。

表1 抗阻運(yùn)動(dòng)方案

注：BW為自身體重。

1.3 主要試劑及儀器 淋巴細(xì)胞分離液(天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司，批號(hào)：LTS1092)，EGM-2MV培養(yǎng)基(Lonza公司，批號(hào)：CC-3162)，纖維粘連蛋白(RD公司，批號(hào)：1918-FN-02M)，T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶(Corning公司，批號(hào)：430168)，DiI標(biāo)記的乙酰化低密度脂蛋白(DiI-labelled acetylated low density lipoprotein,DiI-ac-LDL；Molecular Probes公司，批號(hào)：L3484)，異硫氰酸熒光素標(biāo)記的荊豆凝集素Ⅰ(fluorescein isothiocyanate-labelled ulex europaeus agglutinin Ⅰ,FITC-UEA-Ⅰ；Sigma公司，批號(hào)：L9006)，PI3K/AKT通路特異性抑制劑LY294002(MedChemExpress公司，批號(hào)：B524631337769)，BD MatrigelTM基底膜基質(zhì)(Corning公司，批號(hào)：354230)，μ-Slide Angiogenesis板(ibidi公司，批號(hào)：81506)，cDNA合成試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司，批號(hào)：K1622)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(QIAGEN公司，批號(hào)：208054)，放射免疫沉淀(radio immunoprecipitation assay，RIPA)裂解液(碧云天公司，批號(hào)：P0013B)，苯甲基磺酰氟溶液(索萊寶公司，批號(hào)：P8340)，蛋白磷酸酶抑制劑(索萊寶公司，批號(hào)：P1260)。一抗：抗β-肌動(dòng)蛋白單克隆抗體(索萊寶公司，批號(hào)：K200058M)、AKT抗體(CST公司，批號(hào)：9272s)、PI3Kp85(19H8)兔單克隆抗體(CST公司，批號(hào)：4257s)；二抗：兔抗小鼠IgG(碧云天公司，批號(hào)：P0023D)。激光共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司，型號(hào)：OLYMPUS CKX53)。

1.4 EPCs體外分離培養(yǎng)及鑒定 運(yùn)動(dòng)干預(yù)第8周結(jié)束后處死小鼠進(jìn)行取材。無(wú)菌分離小鼠肱骨、股骨及脛骨并離斷，以含雙抗的無(wú)菌磷酸緩沖鹽溶液(phosphate-buffered saline,PBS)充分沖洗骨髓腔，沖洗時(shí)間至少5 min，將收集的骨髓腔沖洗液輕柔吹打均勻后，按1 ∶1體積比緩慢滴加于淋巴細(xì)胞分離液上，4℃下2 000 r/min離心20 min后用巴氏吸管吸取出中間白色云霧狀細(xì)胞層，加入PBS清洗細(xì)胞以去除殘留的淋巴細(xì)胞分離液，4℃下2 000 r/min離心5 min獲取細(xì)胞沉淀，加入EGM-2MV培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。將細(xì)胞培養(yǎng)物接種于包被了纖維粘連蛋白的T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，放置于5% CO2培養(yǎng)箱中，37℃恒溫培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每3天換液1次，去除非貼壁細(xì)胞。待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%，進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)并進(jìn)行EPCs的鑒定。取EPCs以2.5×105個(gè)/孔的密度平鋪于24孔培養(yǎng)板，加入1 mL DiI-ac-LDL，使Dil-ac-LDL最終濃度為10 μg/mL，5% CO2、95%飽和濕度培養(yǎng)箱孵育4～6 h，1×PBS緩沖液沖洗3次；再取1 mL FITC-UEA-Ⅰ加入24孔板中，使FITC-UEA-Ⅰ最終濃度10 μg/mL，5% CO2、95%飽和濕度培養(yǎng)箱孵育1～2 h后，1×PBS緩沖液沖洗3次。使用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察，Dil-ac-LDL、FITC-UEA-Ⅰ雙染色陽(yáng)性的細(xì)胞被認(rèn)為是正在分化的EPCs。隨機(jī)選取10個(gè)視野，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并計(jì)算EPCs雙陽(yáng)性率。

1.5 PI3K/AKT特異性抑制劑處理細(xì)胞 將聯(lián)合運(yùn)動(dòng)組細(xì)胞分為聯(lián)合運(yùn)動(dòng)組和聯(lián)合運(yùn)動(dòng)+抑制劑組，對(duì)照組細(xì)胞分為對(duì)照組和對(duì)照+抑制劑組。將EPCs接種于12孔板，加入1 μL、濃度為0.7 μmol/L的LY294002至各抑制劑組，于37℃培養(yǎng)箱中孵育1 h，聯(lián)合運(yùn)動(dòng)組與對(duì)照組不給予任何處理。

1.6 EPCs體外血管生成功能實(shí)驗(yàn) 用BD MatrigelTM基底膜基質(zhì)包被μ-Slide Angiogenesis板，鋪板完成后，將其置于4℃冰箱平衡30 min后于37℃培養(yǎng)箱中孵育1 h使BD MatrigelTM基底膜基質(zhì)凝固。取1.5干預(yù)后的EPCs，加入0.5 mL的0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，使其脫壁后常溫下以1 000 r/min離心3 min，棄上清，以完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整至5×104個(gè)/mL，分別取100 μL加入BD MatrigelTM基底膜基質(zhì)包被的μ-Slide Angiogenesis板中，放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后取出培養(yǎng)板，并進(jìn)行拍照。采用Image J圖像分析軟件對(duì)形成的完整管腔進(jìn)行計(jì)數(shù)(每3個(gè)分叉處記為1個(gè)血管腔)。以體外新生血管的主干長(zhǎng)度和節(jié)點(diǎn)作為評(píng)價(jià)體外血管生成功能的標(biāo)準(zhǔn)。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)PI3K、AKT mRNA的表達(dá) 用TRIzol法提取各組細(xì)胞的總RNA并檢測(cè)RNA純度,按cDNA合成試劑盒操作說(shuō)明步驟進(jìn)行擴(kuò)增,設(shè)置反應(yīng)條件：42℃ 60 min，70℃ 5 min。反轉(zhuǎn)錄后，取適量反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物按實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)體系共10 μL，包括2×綠色熒光實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)混合液5 μL、熒光染料0.05 μL、終濃度為0.5 μmmol/L的上下游引物各0.5 μL、cDNA 1 μL，加無(wú)RNA酶水至10 μL；設(shè)置擴(kuò)增反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性2 min后，95℃ 5 s，60℃ 30 s擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。各樣品均重復(fù)3次，采用2-ΔΔCT法計(jì)算相對(duì)表達(dá)水平，以β-肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參，各基因引物見(jiàn)表2。

表2 基因引物序列

1.8 Western blot檢測(cè)AKT、p-AKT蛋白的表達(dá) 取各組細(xì)胞置于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入RIPA裂解液、苯甲基磺酰氟溶液、蛋白磷酸酶抑制劑混合液以裂解EPCs，使用二喹啉甲酸法測(cè)定蛋白濃度，將蛋白進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯膜上。將聚偏二氟乙烯膜置于含有5%脫脂奶粉的玻璃皿上封閉1 h后，1×洗滌緩沖液(tris buffered saline/tween，TBST)溶液洗滌3次，加入一抗室溫?fù)u床孵育2 h，1×TBST溶液洗滌3次(20 min/次)后加入二抗進(jìn)行室溫?fù)u床孵育1 h，最后用Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)(美國(guó)LI-COR公司)掃描，選擇800通道，調(diào)節(jié)明亮度，記錄各組蛋白灰度值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 EPCs形態(tài) 骨髓分離后獲得的EPCs在纖維粘連蛋白包被的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，4 d后EPCs大多呈圓形、短梭形，部分為長(zhǎng)梭形；7 d后圓形細(xì)胞數(shù)量減少，梭形細(xì)胞數(shù)量漸漸增多，可出現(xiàn)細(xì)胞集落；10 d后EPCs大量增殖，并有梭形貼壁細(xì)胞在細(xì)胞集落邊緣不斷生成，可出現(xiàn)“鋪路石”樣改變。見(jiàn)圖1。

圖1 倒置顯微鏡下EPCs的形態(tài)(×100)

注：A為體外培養(yǎng)第48 h后，部分細(xì)胞開(kāi)始貼壁，少量細(xì)胞呈梭形；B為7 d后，EPCs處于貼壁狀態(tài)，多呈梭形或者類(lèi)圓形；C為12 d后，梭形細(xì)胞增多，逐漸長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)瓶底部，可見(jiàn)有“鋪路石”狀改變。

2.2 EPCs的鑒定結(jié)果 在激光共聚焦顯微鏡下可觀察到，胞漿攝取DiI-ac-LDL，顯示紅色，胞膜結(jié)合FITC-UEA-Ⅰ，顯示綠色，雙染色陽(yáng)性細(xì)胞為黃色，為正在分化的EPCs。DiI-ac-LDL及FITC-UEA-Ⅰ雙染陽(yáng)性率為(73.50±7.47)%。見(jiàn)圖2。

圖2 DiI-ac-LDL及FITC-UEA-Ⅰ雙染試驗(yàn)結(jié)果(×200)

注： DiI-ac-LDL染色陽(yáng)性細(xì)胞發(fā)紅色熒光(D)，F(xiàn)ITC-UEA-Ⅰ染色陽(yáng)性細(xì)胞發(fā)綠色熒光(E)，兩者雙染陽(yáng)性細(xì)胞呈黃色熒光(F)。

2.3 各組EPCs的體外血管生成功能 對(duì)照組與對(duì)照+抑制劑組EPCs的主干長(zhǎng)度和節(jié)點(diǎn)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而聯(lián)合運(yùn)動(dòng)組EPCs的主干長(zhǎng)度和節(jié)點(diǎn)均長(zhǎng)于或多于對(duì)照組及聯(lián)合運(yùn)動(dòng)+抑制劑組(均P<0.05)，見(jiàn)圖3和表3。

圖3 各組EPCs體外血管生成功能情況(×100)

注：H為對(duì)照組，I為對(duì)照+抑制劑組，J為聯(lián)合運(yùn)動(dòng)組，K為聯(lián)合運(yùn)動(dòng)+抑制劑組。

表3 各組EPCs的血管生成主干長(zhǎng)度和節(jié)點(diǎn)比較(x±s)

注：與聯(lián)合運(yùn)動(dòng)組比較，#P<0.05。

2.4 各組EPCs的PI3K、AKT mRNA表達(dá)情況 與對(duì)照組比較，對(duì)照+抑制劑組的PI3K、AKT mRNA相對(duì)表達(dá)水平均降低，而聯(lián)合運(yùn)動(dòng)組的PI3K、AKT mRNA相對(duì)表達(dá)水平均升高(均P<0.05)；聯(lián)合運(yùn)動(dòng)+抑制劑組的PI3K、AKT mRNA相對(duì)表達(dá)水平均低于聯(lián)合運(yùn)動(dòng)組(均P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 各組細(xì)胞AKT和PI3K的mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較(x±s)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與聯(lián)合運(yùn)動(dòng)組比較，#P<0.05。

2.5 各組EPCs的AKT、p-AKT蛋白表達(dá)情況 與對(duì)照組比較，對(duì)照+抑制劑組AKT蛋白的相對(duì)表達(dá)水平降低，聯(lián)合運(yùn)動(dòng)組的AKT、p-AKT蛋白的相對(duì)表達(dá)水平均升高(均P<0.05)；聯(lián)合運(yùn)動(dòng)+抑制劑組AKT、p-AKT蛋白的相對(duì)表達(dá)水平均低于聯(lián)合運(yùn)動(dòng)組(均P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 各組EPCs的AKT和p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較(x±s)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與聯(lián)合運(yùn)動(dòng)組比較，#P<0.05。

3 討 論

研究表明，當(dāng)血管內(nèi)皮受損時(shí)，EPCs可以從骨髓動(dòng)員，并遷移、整合到血管網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞從而修復(fù)損傷血管和生成新的血管[4]。而2型糖尿病會(huì)導(dǎo)致EPCs血管生成功能減弱，影響損傷內(nèi)皮的修復(fù)[9]。有文獻(xiàn)報(bào)告，聯(lián)合運(yùn)動(dòng)較單純有氧或抗阻運(yùn)動(dòng)能更有效地改善糖尿病前期人群的糖代謝[10]。然而，目前聯(lián)合抗阻-有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)2型糖尿病患者EPCs血管生成功能的作用尚未十分明確，相關(guān)機(jī)制也尚未清楚。本研究結(jié)果顯示，聯(lián)合運(yùn)動(dòng)組EPCs的主干長(zhǎng)度和節(jié)點(diǎn)均長(zhǎng)于或多于對(duì)照組(P<0.05)，即聯(lián)合運(yùn)動(dòng)組呈現(xiàn)更強(qiáng)的血管修復(fù)能力，提示聯(lián)合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可增強(qiáng)骨髓EPCs的體外血管生成功能。

為了明確聯(lián)合運(yùn)動(dòng)改善EPCs功能活性的可能相關(guān)機(jī)制，本研究對(duì)EPCs上參與血管修復(fù)和生成的PI3K/AKT通路進(jìn)一步探究。PI3K的活化很大程度上依賴(lài)于靠近其質(zhì)膜內(nèi)側(cè)的底物，即多數(shù)生長(zhǎng)因子和信號(hào)傳導(dǎo)復(fù)合物，包括成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、人生長(zhǎng)因子等，都能啟始PI3K的激活過(guò)程[11]。AKT是一類(lèi)蛋白激酶家族的絲氨酸/蘇氨酸激酶，當(dāng)組織損傷后，受損部位能夠釋放某些細(xì)胞因子如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，從而激活PI3K/AKT信號(hào)通路[12]。有研究表明，PI3K/AKT的激活與EPCs的體外血管生成功能密切有關(guān)，參與血管損傷修復(fù)過(guò)程[8]。Dai等[13]發(fā)現(xiàn)阻斷PI3K/AKT的磷酸化激活，可抑制下肢缺血模型糖尿病小鼠的EPCs體外血管生成能力，減少新生血管長(zhǎng)度。而其他學(xué)者發(fā)現(xiàn)，為期14天的游泳干預(yù)可促進(jìn)小鼠EPCs從骨髓動(dòng)員到外周血，增加了外周血EPCs的數(shù)量，新生血管密度升高，并上調(diào)PI3K和AKT的表達(dá)水平；而使用PI3K/AKT通路抑制劑，可抑制小鼠的EPCs動(dòng)員和血管生成功能[14]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，聯(lián)合運(yùn)動(dòng)組AKT、p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)水平上調(diào)(P<0.05)，EPCs血管生成主干長(zhǎng)度和節(jié)點(diǎn)較對(duì)照組增加，這表明聯(lián)合運(yùn)動(dòng)可通過(guò)上調(diào)AKT，改善2型糖尿病小鼠EPCs血管生成功能。本研究進(jìn)一步使用PI3K/AKT抑制劑進(jìn)行干預(yù)觀察，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，對(duì)照+抑制劑組的PI3K、AKT的 mRNA下調(diào)(P<0.05)，AKT、p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量下降(P<0.05)，而兩者EPCs的主干長(zhǎng)度和節(jié)點(diǎn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，即PI3K/AKT抑制劑可有效抑制2型糖尿病小鼠EPCs AKT蛋白的表達(dá)，但對(duì)其血管生成功能無(wú)明顯影響。與未加入PI3K/AKT抑制劑的聯(lián)合運(yùn)動(dòng)組相比，聯(lián)合運(yùn)動(dòng)+抑制劑組PI3K、AKT的 mRNA下調(diào)(P<0.05)，AKT、p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量下降(P<0.05)，同時(shí)EPCs主干長(zhǎng)度和節(jié)點(diǎn)減少(P<0.05)，即抑制AKT的表達(dá)水平，可削弱聯(lián)合運(yùn)動(dòng)對(duì)2型糖尿病小鼠EPCs體外血管生成能力的干預(yù)效果。

總之，8周的聯(lián)合運(yùn)動(dòng)能有效改善2型糖尿病小鼠EPCs的血管生成能力，其機(jī)制可能與上調(diào)AKT密切相關(guān)，抑制AKT的表達(dá)可削弱其干預(yù)效果。本研究為運(yùn)動(dòng)防治糖尿病血管并發(fā)癥提供新的基礎(chǔ)研究依據(jù)和干預(yù)靶點(diǎn)，有關(guān)聯(lián)合運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)EPCs改善血管內(nèi)皮損傷的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。