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        間歇性低氧預(yù)處理對心肌缺血損傷大鼠的心肌保護(hù)作用及其可能機(jī)制▲

        2020-01-02 05:36:06陳依林李光才
        廣西醫(yī)學(xué) 2019年22期
        關(guān)鍵詞:丙二醛谷胱甘肽低氧

        陳依林 胡 克 李光才

        (1 湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院呼吸與危重癥科,恩施市 445000,電子郵箱:2766851633@qq.com;2 武漢大學(xué)人民醫(yī)院呼吸與危重癥科,湖北省武漢市 430000)

        近年來,隨著人民飲食及生活習(xí)慣的改變,我國心肌缺血的發(fā)病率呈現(xiàn)持續(xù)上升的態(tài)勢,其不僅見于中老年人,也發(fā)生于部分20~30歲的年輕人[1-2]。心肌缺血損傷的發(fā)生,與心肌能量代謝障礙、氧自由基大量形成、細(xì)胞凋亡以及心肌血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷等因素均具有密切關(guān)系[3-4]。在正常情況下,機(jī)體可通過自身調(diào)節(jié),實現(xiàn)血液供需的相對恒定,進(jìn)而保證心臟的正常工作,但在多樣化因素影響下心肌血液供需出現(xiàn)失衡,可導(dǎo)致心肌缺血[5-6]。心肌缺血是心臟缺血性疾病常見的發(fā)病機(jī)制,由于心臟血液灌注顯著減少,使得心臟供氧、心肌能量代謝受到嚴(yán)重影響,心臟的正常工作無法得到有效支持。有學(xué)者發(fā)現(xiàn),間歇性低氧可提升心臟對于缺氧、缺血的耐受性,具有一定的心臟保護(hù)效果,對于缺血性心臟病的治療和防控具有積極意義[7]。本研究旨在探討間歇性低氧預(yù)處理對心肌缺血損傷大鼠的保護(hù)作用,以及對轉(zhuǎn)錄因子核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2,Nrf2)表達(dá)水平的影響,為心肌缺血損傷的防控和保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 實驗動物 選取45只健康SD雄性大鼠(購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所,許可證號:SCXK 20090002),均為無特定病原體級別,鼠齡8~10周,體重(180.22±20.12)g。采取隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為對照組、實驗1組和實驗2組,每組15只。入組大鼠的選取和應(yīng)用均符合美國國家衛(wèi)生研究院實驗動物護(hù)理和使用指南要求,本研究通過倫理委員會審查。

        1.2 主要試劑及儀器 肌酸激酶同工酶(creatine kinase MB isoenzyme,CK-MB)試劑盒(國藥準(zhǔn)字:T20020005)、谷胱甘肽試劑盒(國藥準(zhǔn)字:H20030001)、丙二醛試劑盒(國藥準(zhǔn)字:H20040003)均購自南京建成生物工程有限公司,辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG(國藥準(zhǔn)字:S10870044)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,全蛋白濃度測定標(biāo)準(zhǔn)品購自普利萊公司,兔抗小鼠Nrf2抗體(國藥準(zhǔn)字:T20040002)購自Santa Cruz生物科技公司。Eclipse 80i顯微鏡購自日本尼康公司,顯微CT購自美國GE醫(yī)療集團(tuán),CMT4204材料測試儀購自深圳市銀飛電子科技有限公司,R-911全自動放免計數(shù)儀購自中國科技大學(xué)科技實業(yè)總公司,7160全自動生化儀購自日本日立公司。

        1.3 模型構(gòu)建方法 對照組大鼠為假手術(shù)組,使用絲線穿過大鼠左側(cè)冠狀動脈,但是不進(jìn)行結(jié)扎,在尾靜脈注射生理鹽水(40 mg/kg)。實驗1組采用墊扎球囊法[8]構(gòu)建心肌缺血損傷模型。實驗2組構(gòu)建間歇性低氧模型后30 min再采用墊扎球囊法構(gòu)建心肌缺血損傷模型。間歇性低氧模型構(gòu)建方法[9]:首先將大鼠置于6%~8%的低氧環(huán)境2 min,之后實施3 min的氧合處置,每次5個循環(huán),4次/d,連續(xù)進(jìn)行14 d。

        1.4 血清CK-MB、谷胱甘肽和丙二醛水平的檢測 在心肌缺血損傷模型建立2 h后,腹腔注射3%的戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉大鼠,麻醉起效后,經(jīng)由大鼠腹部主動脈采集5 mL血液樣本,4℃下500 r/min離心15 min,離心半徑為6 cm。分離血清,靜置0.5 h后,再分別按照CK-MB、谷胱甘肽和丙二醛的檢測試劑盒說明書檢測各指標(biāo)水平。

        1.5 心肌組織Nfr2蛋白表達(dá)水平的檢測 采用免疫印跡法檢測Nfr2蛋白表達(dá)水平。完成采血后,將大鼠放至75%的乙醇中浸泡消毒。5 min后,在超凈工作臺上無菌狀態(tài)下逐層打開大鼠胸腔,暴露心臟,隨后將心包剪開,從升主動脈處剪下心臟,分離后放置于磷酸緩沖鹽溶液中,反復(fù)沖洗3~4次,確保心腔血液沖洗干凈,用眼科剪剪除左、右心房及右心室、室間隔和大血管,留存左心室,剝離心外膜和心內(nèi)膜。取左心室組織放入含有200 μL裂解液(含苯甲基磺酰氟2 μL)的EP管中,用微量勻漿器于冰上迅速低溫勻漿;待組織充分裂解后,將勻漿液移至另一EP管中,4℃下12 000 r/min離心5 min,取上清,轉(zhuǎn)移到新EP管,標(biāo)記后置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。采用二喹啉甲酸法進(jìn)行蛋白定量后,進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白,將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜,加入含5%脫脂奶粉的TBS封閉緩沖液中,室溫放置1 h;加入特異性Nfr2抗體,在4℃孵育過夜,然后在室溫下孵育1 h,加二抗后利用底物顯色試劑盒進(jìn)行顯影,最后掃描條帶。將β-肌動蛋白作為內(nèi)參蛋白,測量目的條帶的A值,將目的條帶A值和β-肌動蛋白條帶A值的比值,作為轉(zhuǎn)錄因子Nfr2蛋白的相對表達(dá)水平。

        1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以(x±s)表示,組間比較采用t檢驗,多組均數(shù)的比較采用方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié) 果

        2.1 3組大鼠血清CK-MB、谷胱甘肽和丙二醛水平對比 實驗1組的血清CK-MB和丙二醛水平高于對照組,谷胱甘肽水平低于對照組(均P<0.05);實驗2組的血CK-MB和丙二醛水平低于實驗1組,谷胱甘肽水平高于實驗1組(均P<0.05)。見表1。

        表1 3組大鼠血清CK-MB、谷胱甘肽和丙二醛水平對比(x±s)

        注:與對照組相比,*P<0.05,與實驗1組對比,#P<0.05。

        2.2 3組大鼠心肌組織Nrf2蛋白相對表達(dá)水平對比 實驗1組的Nrf2蛋白相對表達(dá)水平低于對照組,而實驗2組的Nrf2蛋白相對表達(dá)水平高于對照組和實驗1組(均P<0.05),見表2。

        表2 3組心肌組織Nrf2蛋白相對表達(dá)水平對比(x±s)

        注:與對照組相比,*P<0.05,與實驗1組對比,#P<0.05。

        3 討 論

        近年來,隨著生活質(zhì)量的提高,我國的人民生活習(xí)慣發(fā)生了很大的變化,導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)生率顯著上升,缺血性心臟病的發(fā)病人數(shù)明顯增加,加之人口老齡化問題的影響,缺血性心臟病的發(fā)病和治療情況較為嚴(yán)峻[10]。心肌缺血發(fā)病的影響因素較多,血壓下降、冠狀動脈阻塞以及主動脈供血減少,均可直接引發(fā)心臟供血下降,此外心瓣膜病、心肌病變以及血黏度的變化也會對心臟供血產(chǎn)生影響,其中冠狀動脈粥樣硬化是心肌缺血最為常見的病因。對于缺血性心臟病的患者,實施再灌注治療可取得較為顯著的效果,但是大部分患者受損的心肌仍并未得到有效修復(fù),甚至還會發(fā)生更加嚴(yán)重的心肌損傷,如心肌梗死面積進(jìn)一步增加等,這些不可逆的嚴(yán)重心肌損害病癥,嚴(yán)重影響患者的健康和生命[11]。因此,心肌缺血損傷的防控,逐漸成為近年來研究的重點(diǎn)內(nèi)容之一。有學(xué)者指出,持續(xù)性的低氧對于機(jī)體會產(chǎn)生不同程度的損傷,但合理地利用間歇性低氧作用機(jī)制,可以有效保護(hù)心肌組織,即間歇性低氧適應(yīng)[12]。

        心肌缺血損傷包含原發(fā)性缺血損傷以及繼發(fā)性的再灌注損傷兩種主要類型,心肌損傷的最基本機(jī)制是心肌的缺血缺氧[13]。本研究構(gòu)建了大鼠心肌缺血損傷模型,并觀察間歇性低氧預(yù)處理的心肌保護(hù)作用。丙二醛屬于活性多不飽和脂肪酸過氧化物降解的產(chǎn)物,其血清水平越高,表明心肌損傷的程度越嚴(yán)重;CK-MB是較為常用的心肌損傷標(biāo)志物之一,可用于心肌損傷和壞死程度的評估;而谷胱甘肽作為組織細(xì)胞中重要的調(diào)節(jié)代謝劑與抗氧化劑,在調(diào)節(jié)機(jī)體自由基代謝方面發(fā)揮顯著作用。因此本研究采用這3種指標(biāo)評價大鼠的心肌損傷情況。結(jié)果顯示,實驗1組的血清CK-MB和丙二醛水平高于對照組,谷胱甘肽水平低于對照組(均P<0.05),提示模型大鼠心肌損傷嚴(yán)重;而實驗2組的血CK-MB和丙二醛水平明顯低于實驗1組,谷胱甘肽水平高于實驗1組(均P<0.05),提示間歇性低氧預(yù)處理可以減輕心肌缺血大鼠心肌損傷程度,并可提高抗氧化因子谷胱甘肽的表達(dá)。

        轉(zhuǎn)錄因子Nrf2是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)過程中的關(guān)鍵性因子之一,能夠與抗氧化反應(yīng)元件因子產(chǎn)生協(xié)同作用,進(jìn)而構(gòu)成Nrf2-抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element,ARE)信號通路[14]。相關(guān)研究表明,Nrf2-ARE信號通路具有細(xì)胞保護(hù)功能,能夠在抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤、抗細(xì)胞凋亡以及抗炎性反應(yīng)和神經(jīng)保護(hù)方面發(fā)揮顯著的效果,還具有顯著且廣泛的機(jī)體抗氧化還原作用[15]。Nrf2能夠調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)激,屬于細(xì)胞抗氧化還原中較為重要的轉(zhuǎn)錄因子,在Nrf2-ARE信號通路形成后,可清除細(xì)胞內(nèi)氧自由基,上調(diào)多種抗氧化酶和解毒酶的表達(dá),同時還能夠上調(diào)超氧化物歧化酶、谷胱甘肽以及多種抗氧化物質(zhì)的表達(dá)水平,對維持細(xì)胞氧化還原平衡狀態(tài)的穩(wěn)定具有顯著效果[16]。心肌氧化還原損傷最主要的表現(xiàn)是心肌缺血再灌注損傷,Nrf2屬于中樞轉(zhuǎn)錄因子,能夠在內(nèi)源性抗氧化途徑中發(fā)揮顯著作用,同時對于Ⅱ相解毒酶以及抗氧化劑的表達(dá),具有顯著的調(diào)節(jié)作用,因此可以作為心肌保護(hù)治療的一個靶點(diǎn)。本研究進(jìn)一步檢測了大鼠心肌組織Nrf2蛋白表達(dá)水平,以探討間歇性低氧對心肌保護(hù)作用的可能機(jī)制。結(jié)果顯示,實驗1組的Nrf2蛋白相對表達(dá)水平低于對照組,而實驗2組的Nrf2蛋白相對表達(dá)水平高于實驗1組(均P<0.05),這提示間歇性低氧預(yù)處理能夠促進(jìn)心肌缺血損傷大鼠心肌組織Nrf2蛋白的表達(dá)。因此,我們推測間歇性低氧處理可以通過Nrf2-ARE信號通路,實現(xiàn)調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)激的作用,進(jìn)而促進(jìn)谷胱甘肽等抗氧化因子的表達(dá),從而實現(xiàn)對于心肌缺血損傷大鼠心肌的保護(hù)作用。

        綜上所述,間歇性低氧預(yù)處理對心肌缺血損傷大鼠具有一定的心肌保護(hù)作用,并且這種保護(hù)作用可能與上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的表達(dá)有關(guān),但具體的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。

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