馬佳歌 徐 麗 倪春蕾 張高鵬 郭蓮東 程建軍

（東北農業(yè)大學食品學院 哈爾濱 150030）

發(fā)酵谷物食品是通過自然環(huán)境或人工加入微生物而發(fā)酵所獲得的制品，其具有特殊的風味及質地，具有較長的保存期[1]。糯玉米黏豆包是我國北方滿族的一種民族特色食品，其歷史悠久，深受人們的喜愛。黏豆包的傳統(tǒng)生產多以糯玉米為主要原料，借助于自然環(huán)境和天然附著在谷物上的乳酸菌等有益微生物，初始乳酸菌數(shù)較低，發(fā)酵進程較為緩慢，產品質量不易控制[2]。隨著消費者對食品安全的日益關注及食品工業(yè)的迅速發(fā)展，迫切地需要實現(xiàn)糯玉米黏豆包加工的標準化及規(guī)范化，而采用人工接種發(fā)酵劑正好能滿足這一需求。與傳統(tǒng)發(fā)酵谷物食品相比，在谷物制品中添加乳酸菌可以擴大所需微生物的數(shù)量，既能縮短發(fā)酵周期，提高品質的穩(wěn)定性，又可使產品形成更好的風味化合物，改善食品的品質[3]。

為了闡明微生物在黏豆包發(fā)酵過程中的作用機制，李琦等[4]從糯玉米自然發(fā)酵過程中分離出優(yōu)勢植物乳桿菌，發(fā)現(xiàn)其具有生長量大，產酸速度快等優(yōu)越性能。楊健等[5]采集不同東北黏豆包的發(fā)酵面團，經聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳技術發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌和條帶豐度最高，此外檸檬明串珠菌、乳酸乳球菌等呈現(xiàn)多態(tài)性。乳酸菌作為發(fā)酵谷物中常用的發(fā)酵劑被人們廣泛利用，在發(fā)酵過程中起優(yōu)勢主導菌群的作用。此外，也有很多關于乳酸菌復合發(fā)酵劑用于發(fā)酵谷物制品的報道，證實了其在產品質量及風味的改善，抑制致病微生物增殖等方面具有很大的優(yōu)勢[6-7]。

本試驗前期確定了糯玉米黏豆包發(fā)酵劑的菌種及其配比，并對其培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件進行了研究。在此基礎上，將獲得的發(fā)酵劑應用于糯玉米黏豆包的發(fā)酵生產中，探討人工接種發(fā)酵獲得的黏豆包新產品與傳統(tǒng)自然發(fā)酵黏豆包成品的感官及質構品質，期望對黏豆包的標準化、工業(yè)化生產提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試菌種：植物乳桿菌 （Lactobacillus plantarum A9）和彎曲乳桿菌 （Lactobacillus curvatus A2）是本實驗室從黑龍江省哈爾濱市阿城區(qū)亞溝鎮(zhèn)自然發(fā)酵的黏豆包樣品中分離、篩選出的性狀和發(fā)酵性能優(yōu)良的兩株優(yōu)勢乳酸菌，保存于東北農業(yè)大學食品學院實驗室。腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides LN1），植物乳桿菌（Lacto-bacillus plantarum V3），植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum BG112）為商業(yè)購買的菌株。

培養(yǎng)基：MRS液體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母浸粉5 g/L，乙酸鈉 5 g/L，K2HPO42 g/L，檸檬酸銨 2 g/L，吐溫-80 1 g/L，MgSO4·7H2O 0.58 g/L，MnSO4·4H2O 0.25 g/L，pH 6.8，121℃下高壓滅菌20 min。

糯玉米糝：市售；玉米汁：將糯玉米糝粉碎，加水1 L后于80℃下煮2 h，邊煮邊搗碎然后用紗布過濾，最后補足失水至所需體積。其余試劑均采用分析純。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1D型超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；HZQ-F100型恒溫振蕩培養(yǎng)箱，哈爾濱市東聯(lián)生化儀器有限公司；TDL-40B型離心機，上海安亭科學儀器有限公司；TA-XT Plus物性測定儀，英國SMSTA公司。

1.3 方法

1.3.1 pH和酸度的測定 發(fā)酵液的pH值使用具有E-201-C型電極的pH計進行測量?？偹岫鹊臏y定采用滴定酸度法，參照GB5009.239-2016和董英麗等[8]的研究方法。

1.3.2 活菌總數(shù)的測定 采用平板菌落計數(shù)法[9]。

1.3.3 黏豆包發(fā)酵劑的研究 分別將5株乳酸菌以體積分數(shù)3%的接種量接入100 g/L脫脂乳培養(yǎng)基中，控制發(fā)酵溫度為37℃，每隔4 h取發(fā)酵液測定其pH和發(fā)酵液的酸度，通過菌株的產酸特性及活菌數(shù)，確定用于發(fā)酵生產黏豆包的發(fā)酵菌株。

1.3.4 黏豆包發(fā)酵劑培養(yǎng)基的研究 在預試驗的基礎上，確定脫脂乳添加量、碳源、氮源及營養(yǎng)因子的種類和添加量，采用按表1所示的因素水平表設計 L16（45）的正交試驗。

表1 正交試驗方案設計Table1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.3.5 黏豆包發(fā)酵劑培養(yǎng)條件的研究 在預試驗的基礎上，選取培養(yǎng)溫度（20，25，30，35，37℃）、初始 pH（5.8，6.2，6.6，7.0，7.4）、裝料量 （20，30，40，50，60 mL/250 mL）作為影響因素，以發(fā)酵劑的活菌數(shù)為指標進行試驗。

1.3.6 糯玉米黏豆包的制作 糯玉米→篩選淘洗→瀝干→加水浸泡（為原料質量的3倍）→接種乳酸菌發(fā)酵劑發(fā)酵（接種量3%）或自然發(fā)酵→清水投洗→膠體磨磨漿→脫水→包餡→成型→冷凍→蒸煮成熟→糯玉米黏豆包成品[10]。

1.3.7 人工接種發(fā)酵與自然發(fā)酵糯玉米黏豆包的品質研究

1.3.7.1 黏豆包發(fā)酵液pH和酸度的測定 參照1.3.1節(jié)中的方法。

1.3.7.2 黏豆包感官品質的測定 分別取待測黏豆包樣品10個/種，采用10名具有專業(yè)知識儲備的人組成評鑒小組，對不同的黏豆包產品進行評分。選取氣味、色澤、外觀形態(tài)、口感、滋味作為判斷黏豆包成品品質的評價指標，各項指標的分值均為20分，詳見表2。

黏豆包成品的綜合得分=（氣味+色澤+外觀形態(tài)+口感+滋味）/5

1.3.7.3 黏豆包質構品質的分析 將制作好的樣品糯玉米黏豆包于常溫放置5 min后，置于測試臺上進行質構測定（texture profile analysis，TPA）。糯玉米黏豆包TPA具體參數(shù)設置為[11]：采用P/0.5S球形質構探頭；觸發(fā)值為5 g；壓縮距離為5 mm；測試前速度為2.00 mm/s；測試速度為1.00 mm/s；測試后速度為5.00 mm/s。檢測的指標包含：硬度、黏性、彈性、粘聚性、膠著性、咀嚼性和回復性。

表2 黏豆包成品的感官評價Table2 Sensory evaluation of the fermented Niandoubao

1.3.8 數(shù)據(jù)處理方法 試驗數(shù)據(jù)的平均值和標準差通過Microsoft Excel 2007軟件進行計算，指標之間的差異通過SPSS statistics 19軟件進行分析，并采用Origin 8.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 黏豆包發(fā)酵劑的菌種選擇

2.1.1 黏豆包發(fā)酵菌種的選擇 對5株發(fā)酵性能優(yōu)良的供試菌株進行發(fā)酵特性的研究，在發(fā)酵24 h過程中發(fā)酵液的pH值變化規(guī)律如圖1所示。發(fā)現(xiàn)5株菌株都可以較好的適應脫脂乳培養(yǎng)基的環(huán)境。隨著發(fā)酵時間的延長，各菌株對應的pH值均下降較快，而后趨于穩(wěn)定。發(fā)酵初期4 h內，pH值下降多較為緩慢，乳酸菌多數(shù)處于生長的遲緩期[12]；從4 h開始至16 h，乳酸菌的代謝活力旺盛，乳酸大量積累，pH值下降迅速，這是由于此時菌體的活力旺盛，分泌乳酸、乙酸等有機酸[13]。16 h至24 h的pH變化不顯著（P＞0.05）。發(fā)酵24 h時，5株乳酸菌的pH值下降到4.21±0.06至4.63±0.03并基本保持穩(wěn)定，其中植物乳桿菌A9的pH顯著低于其它4株乳酸菌發(fā)酵液的pH值（P＜0.05），此外植物乳桿菌V3、腸膜明串珠菌LN1、植物乳桿菌BG112和彎曲乳桿菌A2的發(fā)酵液pH值依次升高。

由圖2可知，5株乳酸菌的產酸曲線呈上升趨勢，發(fā)酵24 h后其酸度含量在（0.90±0.02）%至（1.02±0.01）%范圍內。酸度的快速升高能有效抑制腐敗微生物的繁殖[14]。植物乳桿菌A9的產酸速率最快，酸度最高可達（1.01±0.02）%，顯著高于另外4株乳酸菌（P＜0.05）。早有研究表明在谷物發(fā)酵初期腸膜明串珠菌多為優(yōu)勢菌[15]，而本研究中腸膜明串珠菌LN1的產酸量居中，且作為異型發(fā)酵乳酸菌，其代謝產物除乳酸外還包含乙酸、琥珀酸、和乙醇等，能增強產品的特征風味[16]。因此，優(yōu)選植物乳桿菌A9和腸膜明串珠菌LN1復配。

圖1 發(fā)酵產物pH值隨時間的變化規(guī)律Fig.1 Changes of pH value during fermentation

圖2 發(fā)酵產物可滴定酸度隨時間的變化規(guī)律Fig.2 Changes of titratable acidity during fermentation

2.1.2 黏豆包發(fā)酵菌種配比的選擇 菌種發(fā)酵產酸能力的強弱和活菌數(shù)的多少是衡量其發(fā)酵性能的主要指標。優(yōu)選菌株植物乳桿菌A9和腸膜明串珠菌 LN1 的配比分別為 3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3時，發(fā)酵過程中產物的pH和活菌總數(shù)隨發(fā)酵時間的變化情況如圖3和圖4所示。經24 h體系pH在3.69±0.01至4.05±0.06范圍內，且均顯著低于圖1中任意一株菌株單獨培養(yǎng)（P＜0.05），這說明兩株乳酸菌以不同配比培養(yǎng)可以良好的生長，活菌數(shù)均顯著增加。隨著培養(yǎng)時間的增加，不同配比菌株在培養(yǎng)基中的生長趨勢和速度相當，這表明兩種乳酸菌之間沒有拮抗作用，可復配用于共同發(fā)酵。并且，當植物乳桿菌A9和腸膜明串珠菌LN1的比例為2∶1時，其產酸和活菌數(shù)均高于其它比例。因此，選擇植物乳桿菌A9和腸膜明串珠菌LN1之間的比例為2∶1用于之后的研究。

圖3 菌種比例對發(fā)酵產物pH值的影響Fig.3 Effect of lactic acid bacteria ratio on pH value of products

圖4 不同菌種比例對發(fā)酵產物活菌數(shù)的影響Fig.4 Effect of lactic acid bacteria ratio on viable cells of products

2.2 黏豆包菌種發(fā)酵培養(yǎng)基的確定

在單因素試驗的基礎上，以活菌數(shù)作為目標值，研究培養(yǎng)基配方對菌體生長的影響。L16（45）正交試驗的結果如表3所示。

如表3所示為正交試驗的直觀分析表，由極差分析結果可知，在本試驗范圍內各因素對活菌數(shù)影響的大小依次為D＞B＞A＞C，即玉米汁濃度＞葡萄糖濃度＞脫脂乳濃度＞玉米蛋白粉濃度。目標值活菌數(shù)越大越好，故較佳的組合為：A2B3C2D3。進行3次重復試驗驗證，得到活菌數(shù)為1.57×109CFU/mL，該配方下的活菌數(shù)高于A1B3C3D3的結果。因此，脫脂乳150 g/L，葡萄糖30 g/L，玉米蛋白粉10 g/L，玉米汁40 g/L為黏豆包發(fā)酵培養(yǎng)基的較優(yōu)配方。

表3 正交試驗結果Table3 Results of orthogonal experiment

2.3 黏豆包菌種發(fā)酵培養(yǎng)條件的確定

2.3.1 培養(yǎng)溫度對活菌數(shù)的影響 分別控制菌體的培養(yǎng)溫度為 20，25，30，35，37℃，對不同初始培養(yǎng)溫度下的活菌數(shù)進行比較，結果如圖5所示。發(fā)酵溫度不同，培養(yǎng)基中的活菌總數(shù)亦不同，溫度對培養(yǎng)基中的活菌數(shù)影響較大。溫度變化會影響酶促反應速率和細胞膜流動性，進而影響細胞物質的合成、營養(yǎng)物質的吸收及代謝產物的分泌，最終影響微生物的生長[17]。過低或過高的培養(yǎng)溫度對菌體的生長繁殖均可造成不良影響。培養(yǎng)基中活菌數(shù)在30℃時達到最大值。因此，在本試驗的范圍內確定發(fā)酵劑的最佳培養(yǎng)溫度為30℃。

2.3.2 初始pH對活菌數(shù)的影響 本試驗對不同初始pH值條件下的活菌數(shù)進行了比較，結果如圖6所示。pH對微生物的代謝活動有顯著的影響[18]。由圖6可知，乳酸菌發(fā)酵劑的初始pH值不同，其活菌數(shù)也不盡相同，當控制發(fā)酵劑的初始pH值為6.6時，培養(yǎng)基內的活菌數(shù)達到最大水平，顯著高于其它初始pH值條件下的活菌數(shù) （P＜0.05）。因此，選擇發(fā)酵劑的初始pH值為6.6進行下一步研究。

2.3.3 裝料量對活菌數(shù)的影響 裝料量從20 mL/250 mL至60 mL/250 mL變化時，培養(yǎng)基中活菌數(shù)的變化情況如圖7所示。如圖可知，當培養(yǎng)時間達到16 h時，裝料量為40 mL/250 mL培養(yǎng)基中的活菌數(shù)達到最高水平 （2.04±0.06）×109CFU/mL，這可能是由于裝料量會對溶氧量造成影響，繼而影響菌體生長[19]。因此，選擇發(fā)酵劑的裝料量為40 mL/250 mL較為適宜。

2.4 人工接種發(fā)酵與自然發(fā)酵糯玉米黏豆包的品質分析

2.4.1 黏豆包發(fā)酵液的pH及可滴定酸度 在發(fā)酵谷物生產黏豆包的過程中，發(fā)酵液的pH和酸度是衡量發(fā)酵是否結束的重要指標之一。一般認為，當發(fā)酵液pH達到3.5～4.0左右時，制成黏豆包風味最佳。由圖8可以看出，隨著發(fā)酵時間的增加，黏豆包發(fā)酵液的pH均逐漸降低，酸度逐漸升高。前期，加入發(fā)酵劑的發(fā)酵液pH值及酸度變化較為顯著，而自然發(fā)酵則較為緩慢。加入乳酸菌發(fā)酵劑在發(fā)酵初期0～2 d，乳酸菌代謝活力旺盛，這可能是由于乳酸菌發(fā)酵劑的加入使優(yōu)勢菌群主導發(fā)酵，體系內的pH值迅速下降[20]。從第3天開始，產酸能力稍有降低，pH及酸度變化放緩。由于營養(yǎng)物質等條件的限制，第8天開始進入衰亡期，乳酸菌數(shù)量減少，活力降低，酸度開始上升。9 d后發(fā)酵液變得渾濁，影響食用品質，故應該在第9天前停止發(fā)酵。傳統(tǒng)自然發(fā)酵周期較長，11 d后感官較好，且從第12天開始，制成成品產生酸臭異味，不宜食用，故應在12 d前停止發(fā)酵。由此表明，采用乳酸菌發(fā)酵劑能將發(fā)酵時間從12 d左右縮短至9 d左右，明顯縮短發(fā)酵周期，提高了生產效率。

圖5 發(fā)酵溫度對發(fā)酵產物活菌數(shù)的影響Fig.5 Effects of different fermentation temperatures on viable cell counts of products

圖6 初始pH對發(fā)酵產物活菌數(shù)的影響Fig.6 Effects of different initial pH value on viable cell counts of products

圖7 裝料量對發(fā)酵產物活菌數(shù)的影響Fig.7 Effects of different quantity of medium on viable cell counts of products

圖8 在黏豆包發(fā)酵過程中發(fā)酵液的pH值和可滴定酸度的變化Fig.8 pH and titratable acidity of the fermentation broth during the fermentation process

2.4.2 黏豆包的質構品質分析 將人工接種發(fā)酵劑生產的糯玉米黏豆包與自然發(fā)酵糯玉米黏豆包的質構品質進行比較，結果如表4所示。

由表4可知，人工接種發(fā)酵劑生產的糯玉米黏豆包和自然發(fā)酵糯玉米黏豆包的硬度、彈性、粘聚性、膠著性及回復性的數(shù)值大致相似，且不存在顯著的差異（P＞0.05）。而人工接種發(fā)酵糯玉米黏豆包的黏性和咀嚼性均顯著高于傳統(tǒng)自然發(fā)酵糯玉米黏豆包（P＜0.05），這可能是由于乳酸菌發(fā)酵劑的加入使優(yōu)勢菌群主導發(fā)酵，乳酸菌的代謝產物及淀粉顆粒的改性對于黏豆包質構的形成有重要影響[21]。

表4 糯玉米黏豆包質構品質的分析Table4 Analysis of texture quality of fermented waxy corn Niandoubao

2.4.3 黏豆包的感官品質分析 將人工接種發(fā)酵劑生產的糯玉米黏豆包與自然發(fā)酵糯玉米黏豆包的感官品質進行比較，結果如表5和圖9所示。由表5可知，不論是人工接種發(fā)酵獲得的糯玉米黏豆包還是自然發(fā)酵產品，其感官品質都能令人較為滿意，評分均達到70分以上，且接種發(fā)酵劑生產的黏豆包的感官評分顯著高于傳統(tǒng)自然發(fā)酵（P＜0.05）。這可能是由于傳統(tǒng)自然發(fā)酵時間過長，導致游離脂肪酸含量上升，易產生不潔氣味[22]，且雜菌較多會產生較多不良風味物質，導致黏豆包的感官較差。

表5 糯玉米黏豆包感官品質的分析Table5 Analysis of sensory quality of fermented waxy corn Niandoubao

圖9可以直觀地看出，人工接種發(fā)酵劑和自然發(fā)酵的各項感官指標雖大致相似，卻可以顯著區(qū)分，人工接種發(fā)酵劑發(fā)酵的雷達圖面積及周長均大于傳統(tǒng)自然發(fā)酵；此外，人工接種發(fā)酵劑的黏豆包在氣味、口感和外觀形態(tài)等方面的評分明顯高于傳統(tǒng)自然發(fā)酵。這可能是由于乳酸菌在抑制腐敗菌生長及賦予產品風味等方面具有明顯作用[23-24]。

加入乳酸菌發(fā)酵劑會使黏豆包的感官品質及質構特性發(fā)生一定的改變，這就為乳酸菌菌劑在黏豆包發(fā)酵領域中應用提供了可能，研究結果對提高糯玉米黏豆包的品質、保證糯玉米黏豆包的品質安全具有借鑒意義，為繼續(xù)深入地研究糯玉米黏豆包的工業(yè)化生產提供了重要的參考。

圖9 黏豆包感官評分的雷達圖分析Fig.9 Radar chart of sensory scoring of Niandoubao

3 結論

1）根據(jù)菌株的發(fā)酵性能及生長特性，篩選植物乳桿菌A9和腸膜明串珠菌LN1作為糯玉米黏豆包的發(fā)酵菌種。二者混合培養(yǎng)時發(fā)酵性能良好，以菌種比例為2∶1作為發(fā)酵劑時，產酸量和活菌數(shù)具有顯著優(yōu)勢。

2）采用單因素和正交試驗法優(yōu)化的最佳培養(yǎng)基配方為脫脂乳150 g/L，葡萄糖30 g/L，玉米蛋白粉10 g/L，玉米汁40 g/L；最佳培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度30℃，初始pH值為6.6，裝料量40 mL/250 mL，最終活菌數(shù)可達（2.04± 0.06）×109CFU/mL。

3）通過人工接種乳酸菌發(fā)酵劑生產糯玉米黏豆包可使發(fā)酵過程快速啟動，得到糯玉米黏豆包的黏性、咀嚼性及感官質量要優(yōu)于傳統(tǒng)自然發(fā)酵（P＞0.05）。人工接種乳酸菌發(fā)酵劑具有發(fā)酵周短、利于工業(yè)化生產等優(yōu)勢，可應用于糯玉米黏豆包的生產。