劉美宏 劉回民 謝佳函 徐 倩 王嬌嬌 吳 熙 潘 聰 鄭明珠 劉景圣 *

（1 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 長(zhǎng)春 130118

2 小麥與玉米深加工國家工程實(shí)驗(yàn)室 長(zhǎng)春 130118

3 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 長(zhǎng)春 130118）

過去的40年中，全球肥胖人數(shù)激增對(duì)人類健康構(gòu)成極大威脅[1]。肥胖是II型糖尿病、高血壓、動(dòng)脈硬化等代謝疾病的主要誘因，是體內(nèi)脂肪細(xì)胞積聚過多而導(dǎo)致的一種病理狀態(tài)。抑制脂肪生成，防止肥胖的天然組分開發(fā)成為研究熱點(diǎn)[2]。玉米黃素是玉米中黃色素的主要成分，是葉黃素的同分異構(gòu)體，屬于類胡蘿卜素的一種，在自然界中廣泛存在。在食品中以黃玉米、蛋黃和枸杞等含量最多，人體無法自身合成，必須通過食物或補(bǔ)充劑獲得。玉米黃素分子結(jié)構(gòu)含有11個(gè)共軛雙鍵，具有較強(qiáng)的抗氧化活性[3]。人類多種代謝疾病均與體內(nèi)氧化應(yīng)激有關(guān)，玉米黃素能夠有效預(yù)防視網(wǎng)膜黃斑變性、癌癥、心腦血管疾病[4]，調(diào)節(jié)免疫功能，改善體內(nèi)炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激水平[5]。

相比于β-胡蘿卜素、蝦青素、番茄紅素等類胡蘿卜素，玉米黃素降脂作用的研究甚少。Li等[6]利用玉米黃素對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞的增殖分化進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)玉米黃素可顯著抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞的增殖和脂肪細(xì)胞脂質(zhì)累積。李紅艷等[7-8]研究發(fā)現(xiàn)玉米黃素具有保護(hù)高脂誘發(fā)鵪鶉血管脂質(zhì)過氧化損傷的作用。本研究中添加玉米黃素干預(yù)高脂飲食誘導(dǎo)C57BL/6J肥胖小鼠，檢測(cè)玉米黃素對(duì)肥胖小鼠體內(nèi)脂質(zhì)累積及肝臟組織脂質(zhì)代謝相關(guān)因子表達(dá)的影響，明確玉米黃素對(duì)肥胖的防治效果，為進(jìn)一步開發(fā)富含玉米黃素的功能性食品提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

C57BL/6J小鼠，雄性，60只，體重17～20 g，SPF級(jí)，購自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（遼）2015-0001。高脂飼料（生長(zhǎng)繁殖飼料33%，酪蛋白粉20%，氫化椰子油22%，豆油17%）由吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院提供。

玉米黃素，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用純度為75%（其它雜質(zhì)為葉黃素），購自深圳格瑞博生物科技有限公司。

1.2 試劑與儀器

TRIzol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript II 1stStrand cDNA Synthesis Kit、熒光染料SYBR Premix Ex Taq TM （Tli RNaseH Plus） 均 購 自TAKARA公司，引物由長(zhǎng)春海靈生物科貿(mào)有限公司負(fù)責(zé)設(shè)計(jì)并送TAKARA進(jìn)行合成，兔抗AMPK、p-AMPK和β-actin單克隆抗體均購自CST。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，碧云天生物科技公司。其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

Allegra X-30R高速離心機(jī)，美國Beckman公司；-80℃超低溫冰箱，美國Thermo公司；熒光倒置顯微鏡，德國Carl Zeiss公司；電子分析天平，德國Sartorius公司；TissuePrep快速組織細(xì)胞破碎儀，拜普諾（北京）貿(mào)易有限公司；PCR儀，德國Eppendorf公司；Agilent Stratagene Mx3000P 熒光定量PCR儀，美國安捷倫公司；凝膠電泳儀、半干轉(zhuǎn)膜儀，美國伯樂公司；凝膠成像分析系統(tǒng)，美國GE公司。

1.3 方法

1.3.1 給藥劑量 參照Sajilata等[9]研究，推薦玉米黃素人均日攝入量為2 mg/kg，本試驗(yàn)劑量設(shè)置為人體推薦量的10和20倍，故擬采用20和40 mg/kg劑量玉米黃素進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.2 動(dòng)物分組及飼養(yǎng) 60只小鼠根據(jù)Excel隨機(jī)數(shù)法隨機(jī)分為4組，分籠喂養(yǎng)，對(duì)照組（15只）使用正常的生長(zhǎng)飼料，其余3個(gè)模型組（45只）使用高脂飲食飼料（脂肪比重大于26%），每周稱重。4周后根據(jù)體重增長(zhǎng)情況，對(duì)模型組小鼠進(jìn)行篩選，選擇體重超重的繼續(xù)喂養(yǎng)，體重?zé)o顯著變化的（具有高脂抗性）篩除。每組小鼠數(shù)量設(shè)置為12只。將合格的模型小鼠隨機(jī)分為3組，分別為模型組，玉米黃素高劑量組，玉米黃素低劑量組，高、低劑量組分別按每日40和20 mg/kg灌胃玉米黃素（溶劑為0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，CMC-Na），模型和正常組每日按10 mL/kg灌胃0.5%CMCNa，每日1次，連續(xù)灌胃4周，期間繼續(xù)分別給予正常和高脂飼料。每天觀察小鼠生長(zhǎng)狀態(tài)，定時(shí)稱重[10-11]。

1.3.3 取材及指標(biāo)檢測(cè)方法 給予玉米黃素干預(yù)4周即高脂飲食8周后，C57BL/6小鼠禁食12 h，眼靜脈取血后，取附睪、腸系膜和腎周脂肪以及肝臟組織，稱重，記錄。取肝左葉組織，直接用10%甲醛固定，病理切片的制作和HE染色按照常規(guī)技術(shù)，光學(xué)顯微鏡觀察評(píng)價(jià)和圖片采集，觀察肝臟細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。剩余組織均液氮速凍，-80℃超低溫冰箱凍存。

1.3.4 玉米黃素對(duì)肝臟脂代謝及能量代謝相關(guān)因子表達(dá)的影響 肝臟組織經(jīng)快速組織勻漿器破碎，利用TRIzol試劑提取肝臟總RNA，將高質(zhì)量的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用SYBR熒光染料法檢測(cè)脂代謝相關(guān)因子C/EBPα、SREBP1-c、ACC和CD36的mRNA相對(duì)表達(dá)量。在Agilent Stratagene Mx3000P熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s；40個(gè)循環(huán)：95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s；擴(kuò)增結(jié)束建立PCR 產(chǎn)物的熔解曲線：95℃，1 min；55℃，30 s；95℃，30 s。以 β-actin 為內(nèi)參對(duì)照，采用 2-ΔΔCt相對(duì)定量法計(jì)算各組基因表達(dá)情況?；蛞镄蛄幸姳?。

1.3.5 玉米黃素對(duì)AMPK信號(hào)通路的影響 取適量肝臟組織加入蛋白裂解液，低溫研磨提取總蛋白，利用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒定量，取25 μg變性蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)0.45 μm孔徑 PVDF膜，5%BSA室溫封閉1 h后加入待測(cè)一抗（1∶1 000），4℃孵育過夜；加入相應(yīng)的二抗（1∶2 000），室溫孵育 1 h，用 ECL發(fā)光顯色，凝膠成像分析系統(tǒng)檢測(cè)蛋白的表達(dá)，Quantity one軟件分析試驗(yàn)結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，各數(shù)值用±s表示。多樣本間比較采用Oneway ANOVA檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米黃素干預(yù)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重影響

由表2可知，各組小鼠初始體重?zé)o顯著性差異，造模4周后稱重，模型組C57BL/6J小鼠體重比對(duì)照組顯著（P＜0.05）增加，成功建立高脂飲食誘導(dǎo)肥胖動(dòng)物模型。選取合格模型小鼠用于后續(xù)玉米黃素干預(yù)試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)束后玉米黃素低劑量組小鼠體重增加量顯著降低。結(jié)果表明玉米黃素干預(yù)飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠能夠在一定程度上降低其體重增加量，減緩其肥胖進(jìn)程。

表1 引物序列Table1 Primer sequences

表2 玉米黃素對(duì)高脂飼料誘導(dǎo)肥胖小鼠體重影響（±s，n=12）Table2 The effect of zeaxanthin on body wight of diet-induced obese mice（±s，n=12）

表2 玉米黃素對(duì)高脂飼料誘導(dǎo)肥胖小鼠體重影響（±s，n=12）Table2 The effect of zeaxanthin on body wight of diet-induced obese mice（±s，n=12）

注：# .與正常對(duì)照組比較差異顯著（P＜0.05）；## .與正常對(duì)照組比較差異極顯著（P＜0.01）；*.與高脂模型組比較差異顯著（P＜0.05）；**.與高脂模型組比較差異極顯著（P＜0.01）。下同。

組別 造模期間體重變化 玉米黃素干預(yù)期間體重變化初使體重/g 造模結(jié)束體重/g 初始體重/g 最終體重/g 增加體重/g對(duì)照組 19.03±1.38 21.51±1.66** 21.01±1.30** 22.92±1.23** 1.41±0.05*模型組 19.03±1.17 23.45±1.26## 23.93±1.33## 25.42±0.85## 1.49±0.07# 高劑量組 - - 23.80±0.89## 25.18±0.98## 1.38±0.13# 低劑量組 - - 23.83±1.11## 24.78±1.19# 0.95±0.10*#

2.2 玉米黃素對(duì)腹腔脂肪和肝臟組織質(zhì)量的影響

肥胖會(huì)引起體內(nèi)臟器質(zhì)量變化，從而影響機(jī)體代謝[12]。對(duì)脂肪和肝臟組織進(jìn)行分離并稱重測(cè)定，與對(duì)照組相比，模型組小鼠脂肪總質(zhì)量和肝臟質(zhì)量均顯著升高（P＜0.01 或 P＜0.05）；與模型組相比，玉米黃素具有降低脂肪組織總質(zhì)量的趨勢(shì)，顯著降低肝臟組織質(zhì)量，認(rèn)為玉米黃素減緩體重增加與減緩脂肪組織增生和抑制肝臟組織質(zhì)量增加有關(guān)。

2.3 玉米黃素對(duì)小鼠肝臟組織狀態(tài)的影響

由肝臟組織HE染色結(jié)果可知，對(duì)照組肝組織偏暗紅色，有光澤，肝細(xì)胞形態(tài)正常；模型組肝組織顏色紅色偏淡，肝細(xì)胞周圍有少許白色斑點(diǎn)狀脂肪空泡出現(xiàn)，肝臟表現(xiàn)出輕微脂肪變性；玉米黃素高低劑量組肝臟顏色介于對(duì)照組和模型組之間，且肝細(xì)胞周圍脂肪空泡現(xiàn)象較模型組有所減少。提示玉米黃素干預(yù)可以在一定程度上保護(hù)高脂飲食誘導(dǎo)的肝臟脂肪變性。

2.4 玉米黃素對(duì)肝臟脂質(zhì)代謝與能量代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

高脂飲食使得肝臟組織中成脂轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子C/EBPα、SREBP1-c和脂質(zhì)代謝因子 ACC、CD36的mRNA表達(dá)水平升高，20 mg/kg玉米黃素干預(yù)能夠顯著降低成脂轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα，脂肪合鍵酶ACC和脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CD36的表達(dá)，40 mg/kg玉米黃素干預(yù)能夠顯著降低SREBP1-c、ACC和CD36的表達(dá)。與對(duì)照組相比，高脂飲食顯著降低能量代謝相關(guān)基因PGC-1α、UCP1和SIRT1的基因表達(dá)水平；相比于模型組，20和40 mg/kg玉米黃素干預(yù)能夠顯著提高UCP1的表達(dá)，但對(duì)PGC-1α和SIRT1基因水平無顯著性影響。

圖1 各處理組肝臟組織病理學(xué)變化（HE，200X）Fig.1 The histopathology of liver changed in each group （HE，200X）

表3 玉米黃素對(duì)小鼠腹腔脂肪和肝臟組織質(zhì)量及Lee’s 指數(shù)的影響（n=12）Table3 The effect of zeaxanthin on fat and liver mass and Lee’s index（n=12）

圖2 玉米黃素對(duì)肝臟組織脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的影響 （n=5）Fig.2 Effects of zeaxanthin on mRNA expression involved in lipid metabolism in liver（n=5）

2.5 米黃素對(duì)AMPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響

如圖4所示，與正常飲食對(duì)照組相比，高脂飲食能夠顯著降低AMPK磷酸化蛋白的比例，說明該信號(hào)通路受到一定程度的抑制；與模型組相比，經(jīng)低劑量玉米黃素干預(yù)4周，小鼠肝臟組織p-AMPK蛋白表達(dá)量顯著升高。

圖3 玉米黃素對(duì)肝臟組織能量代謝相關(guān)基因的影響 （n=5）Fig.3 Effects of zeaxanthin on mRNA expression involved in energy metabolism in liver （n=5）

3 討論與結(jié)論

圖4 玉米黃素對(duì)肝臟組織AMPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響（n=3）Fig.4 Effects of zeaxanthin on protein expression involved in AMPK pathway in liver （n=3）

飲食干預(yù)減緩肥胖進(jìn)程已經(jīng)得到越來越多的關(guān)注[15-16]。天然類胡蘿卜素作為一種功能活性物質(zhì)，具有較強(qiáng)的抗氧化活性[17]，在降脂減肥方面也引起了一定的關(guān)注。高脂飲食是目前大多數(shù)人形成肥胖的主要原因，主要表現(xiàn)為促使機(jī)體體重增加。最近研究表明，機(jī)體肥胖狀態(tài)與體內(nèi)氧化應(yīng)激水平密切相關(guān)[18]，提示玉米黃素可能通過改善體內(nèi)氧化應(yīng)激水平發(fā)揮調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的作用。研究普遍認(rèn)為，更高的作用劑量對(duì)應(yīng)著更好的降脂效果，但也有一些研究[19-20]表明，低劑量干預(yù)物比高劑量降脂作用明顯。本研究使用20和40 mg/kg的飼喂劑量，低劑量（20 mg/kg）玉米黃素對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠的肝臟脂質(zhì)代謝基因表達(dá)調(diào)控效果相對(duì)顯著。Hao Han等[21]研究顯示玉米黃素的同分異構(gòu)體葉黃素能夠有效改善高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激，調(diào)控脂質(zhì)代謝，此外還能夠顯著抑制肥胖小鼠體重及內(nèi)臟脂肪組織質(zhì)量，且低劑量效果較好，但血清中，大多數(shù)生化指標(biāo)中劑量組（50 mg/kg）不及低、高兩劑量效果好。Jaswir等[22]研究顯示葉黃素在低濃度時(shí)具有抗氧化效果，而高濃度則表現(xiàn)出促氧化效果。Ali El-Agamey[23]和Klaudia Jomova[24]等研究認(rèn)為高濃度類胡蘿卜素會(huì)降低其抗氧化效果，甚至具有促氧化作用。本研究中觀察到低劑量組降脂效果優(yōu)于高劑量組，推測(cè)原因之一可能與劑量范圍有關(guān)，更高的作用劑量值得進(jìn)一步研究；原因之二可能與玉米黃素本身的抗氧化與促氧化平衡有關(guān)，而體內(nèi)氧化應(yīng)激水平與機(jī)體肥胖狀態(tài)有著緊密的關(guān)系。一些研究表明，相對(duì)高劑量的類胡蘿卜素可由抗氧化劑轉(zhuǎn)變?yōu)榇傺趸瘎25-27]，當(dāng)玉米黃素在磷脂膜上的濃度超過其臨界濃度，會(huì)產(chǎn)生局部聚集并導(dǎo)致其猝滅單線態(tài)氧效果降低[28]，進(jìn)而影響其對(duì)機(jī)體氧化應(yīng)激的保護(hù)作用。因此探尋玉米黃素最佳劑量以達(dá)到最優(yōu)降脂效果值得深入研究。

國內(nèi)外關(guān)于玉米黃素降脂功能研究甚少，李紅艷利用鵪鶉模型從血管脂質(zhì)過氧化保護(hù)方面，孫曉芳[29]利用昆明小鼠模型降低高脂血癥小鼠的血脂方面分別論證了玉米黃素的降脂活性，均認(rèn)為玉米黃素具有良好的降脂功能且呈劑量依賴型。而本研究與前人研究結(jié)果存在部分差異，可能原因是玉米黃素原料、劑量、飼喂周期、飼喂方式以及動(dòng)物模型、造模方法不同所致，尤其是樣品純度和造模方式的差異，前人研究采用高脂建模與玉米黃素干預(yù)同步進(jìn)行，而本研究采用先建立肥胖模型，再飲食干預(yù)的方式。本試驗(yàn)中樣品純度＞75%，其它雜質(zhì)成分經(jīng)HPLC檢測(cè)確定為葉黃素（純度約17%），葉黃素為玉米黃素的同分異構(gòu)體，且二者常共存于食物中，均具有較強(qiáng)的抗氧化活性，這與其生理功能密切相關(guān)。報(bào)道研究[30]，二者淬滅單線態(tài)氧的能力相似。此外，目前我國食品行業(yè)中大部分工業(yè)中間體產(chǎn)品的純度在70%左右。因此，本試驗(yàn)結(jié)果具有一定的實(shí)踐參考價(jià)值。

肝臟是機(jī)體重要的代謝器官，主要參與內(nèi)源性脂肪的合成與轉(zhuǎn)運(yùn)[31-32]。肝臟本不能儲(chǔ)存脂肪，但如果脂質(zhì)代謝動(dòng)態(tài)失衡，則會(huì)導(dǎo)致肝臟攝取游離脂肪酸增加，游離脂肪酸內(nèi)源性合成增加以及甘油三酯運(yùn)轉(zhuǎn)障礙等，最終導(dǎo)致甘油三酯堆積在肝臟細(xì)胞中，導(dǎo)致肝臟脂肪變性[33]。C/EBPα、SREBP1-c、ACC和CD36是參與肝臟脂質(zhì)代謝的重要因子[34-35]。C/EBPα和SREBP1-c是脂肪代謝合成路徑重要的轉(zhuǎn)錄因子，其靶基因包括控制脂肪合成的關(guān)鍵酶ACC和體內(nèi)分布十分廣泛的膜糖蛋白脂肪酸轉(zhuǎn)位酶CD36，共同調(diào)控肝臟對(duì)脂肪酸的攝取[36]。玉米黃素對(duì)肝臟脂質(zhì)累積的保護(hù)作用可能與降低肝臟脂質(zhì)生成與轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)因子C/EBPα、SREBP1-c、ACC和CD36的基因表達(dá)水平有關(guān)。相比于模型組，高、低劑量組對(duì)脂代謝相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響差異不大，但在降脂效果卻體現(xiàn)了一定的差異，這與基因表達(dá)的翻譯調(diào)控及翻譯后蛋白修飾有一定關(guān)系[37]，基因的表型受到環(huán)境及飲食等多種因素的影響，有研究報(bào)道[38]利用核糖體圖譜分析技術(shù)檢測(cè)心臟和肝臟基因，在翻譯水平存在的差異性表達(dá)量是在轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)到的兩倍，并發(fā)現(xiàn)許多在人類心臟和肝臟中表達(dá)的基因主要在翻譯水平受到調(diào)控。本研究中只對(duì)肝臟脂代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了檢測(cè)，接下來有必要針對(duì)其蛋白水平進(jìn)行研究。PGC-1α和UCP1與脂肪細(xì)胞內(nèi)線粒體生物合成和脂肪酸氧化代謝有關(guān)，能夠促進(jìn)白色脂肪組織棕色化，提高能量代謝水平[39]，SIRT1能夠與成脂關(guān)鍵因子PPARγ啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，從而抑制其活性及脂質(zhì)形成[40]?；蛩斤@示玉米黃素干預(yù)能夠在一定程度上提高肥胖機(jī)體的能量代謝水平，但具體的代謝水平差異需要進(jìn)一步研究。AMPK信號(hào)通路在能量代謝中起著非常重要的作用，在肝臟中，AMPK的活化可以抑制葡萄糖和脂質(zhì)的合成，促進(jìn)脂質(zhì)氧化及線粒體的生物合成[41]。

本研究中，肥胖動(dòng)物模型建立成功后，添加20 mg/kg劑量玉米黃素干預(yù)能夠在一定程度上降低小鼠肥胖進(jìn)程，激活A(yù)MPK信號(hào)通路以調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)和能量代謝相關(guān)因子的表達(dá)。為玉米黃素作為功能性食品成分的進(jìn)一步開發(fā)利用奠定了理論基礎(chǔ)。