廖新浴，陳信賢，劉東紅，葉興乾，尹源明，周建偉,3，謝小本，丁 甜

(1. 浙江大學(xué) 生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058; 2. 浙江大學(xué) 馥莉食品研究院，浙江 杭州 310058; 3. 浙江大學(xué) 寧波理工學(xué)院，浙江 寧波 315100；4. 紹興咸亨食品股份有限公司，浙江 紹興 312000)

腐乳是一種傳統(tǒng)的中國(guó)豆類發(fā)酵食品，是由微生物發(fā)酵生產(chǎn)的、類似奶酪的產(chǎn)品，具有獨(dú)特的風(fēng)味，容易被消化，并且具有較高的蛋白質(zhì)含量[1]。腐乳的生產(chǎn)流程一般包括豆腐切塊、酸泔水點(diǎn)漿、接種、發(fā)酵、腌制和加湯料幾大步驟。盡管在發(fā)酵培養(yǎng)中使用純培養(yǎng)物，但豆腐生產(chǎn)過(guò)程在非無(wú)菌開(kāi)放條件下進(jìn)行，導(dǎo)致在生產(chǎn)過(guò)程中細(xì)菌污染的可能性很高。另外，大部分腐乳中雖然含有NaCl (5%～15%)和乙醇(1%～7%)，可以防止病原體存活或生長(zhǎng)[1]，但是對(duì)于可形成芽孢的芽孢桿菌屬(Bacillusspp.)和梭菌屬(Clostridiumspp.)來(lái)說(shuō)，由于芽孢對(duì)環(huán)境壓力的耐受能力比較強(qiáng)，比如對(duì)鹽有耐受性[2]，仍無(wú)法完全抑制它們的存活，從而對(duì)腐乳產(chǎn)品的安全性造成了潛在風(fēng)險(xiǎn)[3]。

本文中，筆者將以紅腐乳的生產(chǎn)過(guò)程為例，對(duì)各個(gè)生產(chǎn)環(huán)節(jié)的細(xì)菌進(jìn)行分離和鑒定，并分析腐乳生產(chǎn)過(guò)程中可能存在的食源性致病菌和腐敗菌，以期對(duì)腐乳生產(chǎn)工藝優(yōu)化和安全性問(wèn)題提供理論依據(jù)和研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)菌DNA提取試劑盒，Personalbio公司；NaCl和甘油，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

2720 PCR擴(kuò)增系統(tǒng)，Applied Biosystems公司；3730XL型DNA測(cè)序分析儀，ABI PRISM公司。

1.2 樣品采集

該實(shí)驗(yàn)的腐乳半成品來(lái)自于紹興的一家豆腐乳工廠，從8個(gè)生產(chǎn)步驟中采集樣品。這8個(gè)生產(chǎn)步驟包括：①豆腐原料；②酸泔水點(diǎn)漿過(guò)程;③培養(yǎng)發(fā)酵噴菌后;④白坯生長(zhǎng)中期(7 d后);⑤白坯生長(zhǎng)后期(14 d后);⑥腌制1 d后；⑦腌制4 d后；⑧添加紅曲后與其他料之后。

1.3 菌種分離與鑒定

將腐乳樣品使用研缽和研杵勻化，取5 g試樣腐乳和45 mL無(wú)菌生理鹽水勻漿。然后將樣品用無(wú)菌生理鹽水連續(xù)適當(dāng)稀釋并涂布到平板上培養(yǎng)2 d，挑取形態(tài)特征不同的單個(gè)菌落到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，并在平板上劃線，將單個(gè)菌落接入液體培養(yǎng)基中，最后分離純化菌種與甘油混合，凍存于-80 ℃。用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取菌體DNA。對(duì)純分離菌株進(jìn)行16S rDNA基因序列分析。通用引物為27F (5′-A￣G￣A￣G￣T￣T￣T￣G￣A￣T￣C￣C￣T￣G￣G￣C￣T￣C￣A￣G-3′)和1492R(5′-G￣G￣T￣T￣A￣C￣C￣T￣T￣G￣T￣T￣A￣C￣G￣A￣C￣T￣T-3′)。PCR反應(yīng)是在2720 PCR擴(kuò)增系統(tǒng)下運(yùn)行并利用下列條件進(jìn)行反應(yīng)：98 ℃ 5 min預(yù)變性，其次26個(gè)周期的擴(kuò)增過(guò)程包括98 ℃(20 s)、98 ℃(20 s)和72 ℃(7 min)，最后在72 ℃保持10 min。使用ABI PRISM 3730XL DNA測(cè)序分析儀進(jìn)行延伸的最后一步。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序(Personalbio公司，上海)，所獲得的序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)(美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心)進(jìn)行BLAST算法比對(duì)。

2 結(jié)果與討論

2.1 紅腐乳生產(chǎn)環(huán)節(jié)中細(xì)菌鑒定結(jié)果

紅腐乳生產(chǎn)環(huán)節(jié)中細(xì)菌鑒定結(jié)果如表1所示。由表1可知：豆腐原料中存在的細(xì)菌主要是蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)和惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)。豆腐是腐乳的生產(chǎn)原料，其蛋白質(zhì)含量為6.0%～8.4%，含水量79%～87%[4]，pH為5.2～6.2[5]。由于其蛋白質(zhì)、水含量高，具有偏中性pH，因此豆腐很容易被微生物污染[6]。在酸泔水點(diǎn)漿過(guò)程中，主要細(xì)菌菌株是金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌，這一結(jié)果與周婷婷等[7]的研究結(jié)果一致，該研究也發(fā)現(xiàn)蠟樣芽孢桿菌存在于凝乳豆腐的酸漿水中。接種過(guò)程中存在的主要細(xì)菌種類是枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌。該步驟中的枯草芽孢桿菌(B.subtilis) 可能來(lái)自于接種劑，作為食品中的安全啟動(dòng)劑存在于隨后的發(fā)酵過(guò)程中[8]。

發(fā)酵中期 (約7 d)主要存在蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumanii)和吉氏庫(kù)特菌(Kurthiagibsonii)；在發(fā)酵后期 (約14 d)主要存在乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、鮑曼不動(dòng)桿菌和陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)；腌制1 d后分離鑒定出的菌種包括陰溝腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌2種菌；而腌制4 d后，腐乳只存在陰溝腸桿菌一種菌種，這一結(jié)果與姚翔等[9]研究結(jié)果一致，隨著腌制時(shí)間的延長(zhǎng)，腐乳中食鹽的作用會(huì)對(duì)芽孢桿菌有一定的抑制作用。而添加紅曲后的腐乳中，菌種主要包括鮑曼不動(dòng)桿菌、蠟樣芽孢桿菌和吉氏庫(kù)特菌3種。

表1 紅腐乳生產(chǎn)環(huán)節(jié)中細(xì)菌鑒定結(jié)果

2.2 腐乳生產(chǎn)過(guò)程中所分離細(xì)菌的特性分析

2.1節(jié)中研究發(fā)現(xiàn)腐乳生產(chǎn)過(guò)程中存在的食源性致病菌為蠟樣芽孢桿菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、糞腸球菌、惡臭假單胞菌、金黃色葡萄球菌和陰溝腸桿菌以及腐敗菌如吉氏庫(kù)特菌和乳酸乳球菌，對(duì)這些細(xì)菌的特性進(jìn)行分析，結(jié)果如表2所示。由表2可知，腐乳生產(chǎn)安全性應(yīng)該給予重視。蠟樣芽孢桿菌是同時(shí)具有致病性和致腐性的微生物[10]，當(dāng)蠟樣芽孢桿菌在腐乳中達(dá)到106cfu/g時(shí)[7]，有可能會(huì)引起惡心、嘔吐和腹瀉的癥狀[11]。蠟樣芽孢桿菌也能產(chǎn)生芽孢，具有耐熱性、耐受冷凍和干燥的特點(diǎn)[11-12]，還能附著于食物接觸表面(例如不銹鋼工具和生產(chǎn)設(shè)備)并形成生物膜，并且在表面上積累[13]。糞腸球菌屬于乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB )，但是它也是一種具有致病性和引起食品腐敗的微生物[14]，能夠引起心內(nèi)膜炎、菌血癥、泌尿、新生兒院內(nèi)感染、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)、腹腔和盆腔感染等。像其他腸球菌一樣，它也可以通過(guò)基因水平轉(zhuǎn)移來(lái)傳播抗生素抗性基因，從而增加全球耐藥性問(wèn)題[15]。惡臭假單胞菌被認(rèn)為是自然環(huán)境和人體表面的廣泛細(xì)菌污染物[16]。已知惡臭假單胞菌引起食物變質(zhì)，并且某些種屬可以分泌與發(fā)病相關(guān)的蛋白質(zhì)，從而可引起尿路感染、敗血癥和胃腸道感染等疾病[17]。金黃色葡萄球菌是導(dǎo)致嚴(yán)重全球性后天感染的重要的人類病原體之一[18]，能產(chǎn)生葡萄球菌腸毒(SE)，從而引起葡萄球菌食物中毒(SFP)[19]。鮑曼不動(dòng)桿菌具有致病性，可引起一系列嚴(yán)重感染病，如血流感染(BSI)等[20-21]，這與其具有的多藥耐藥性(MDR)有關(guān)，但是它很少會(huì)引起腹瀉的癥狀[22]。吉氏庫(kù)特菌可造成食物腐敗，廣泛分布于環(huán)境和農(nóng)場(chǎng)的動(dòng)物、糞便、土壤、地表水、肉類和冷藏后的肉和肉制品中[23]。 乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)可以產(chǎn)生酸性物質(zhì)，如乳酸鏈球菌肽 (Nisin)、Pediocin和其他細(xì)菌素[24]，這些細(xì)胞素主要抑制革蘭氏陽(yáng)性菌，而對(duì)大多數(shù)的革蘭氏陰性菌沒(méi)有抑制效果[25]，這可能是發(fā)酵前期的革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌失去生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的原因[19]。而除了細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)體之外，一些細(xì)菌如蠟樣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌還能產(chǎn)生芽孢。由于芽孢的生存能力很強(qiáng)，不易消滅，而且孢子黏附能力使其能夠在設(shè)備或生產(chǎn)線機(jī)器中殘存，從而導(dǎo)致芽孢更難以被清除，都對(duì)食品安全性造成了潛在的威脅[26]。

表2 腐乳生產(chǎn)過(guò)程中所分離細(xì)菌的特性

3 結(jié)論

本文中，筆者研究發(fā)現(xiàn)腐乳生產(chǎn)過(guò)程中存在一些致病菌或者是腐敗菌。腐乳生產(chǎn)過(guò)程中分離檢測(cè)出的糞腸球菌、惡臭假單胞菌、吉氏庫(kù)特菌、金黃色葡萄球菌和陰溝腸桿菌都屬于食源性致病菌，因此需要引起對(duì)腐乳生產(chǎn)安全性的注意。有必要在前期生產(chǎn)過(guò)程中將污染細(xì)菌降低到最低范圍，以保證后期發(fā)酵時(shí)的微生物安全。保證安全新鮮的豆腐原料是制作豆腐乳的關(guān)鍵控制點(diǎn)。應(yīng)加強(qiáng)維持干凈的生產(chǎn)環(huán)境、個(gè)人、貯藏等過(guò)程中的衛(wèi)生管理。加強(qiáng)菌種管理，傳統(tǒng)發(fā)酵不能夠完全控制微生物活性，所以對(duì)菌種進(jìn)行分離和純化及妥善保藏都是有必要的。