吳家鑫，王 崢，史旭軍，劉沛溢，蘇 寧，閆 妍，王 瑞

(1.北京化工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 北京市生物加工過程重點實驗室，北京 100029；2.桂林長發(fā)小寨生物科技有限公司，廣西 桂林 541000；3.北京佰草國頤堂醫(yī)學(xué)研究院，北京 100012；4.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院 化妝品技術(shù)中心，北京 100176)

微生態(tài)學(xué)(Microexology)由德國Rush博士于1977年首次明確提出，在微生物學(xué)基礎(chǔ)上吸收了生物學(xué)思想而發(fā)展起來，主要研究正常微生物群與其宿主相互依賴、相互制約的邊緣學(xué)科，是細胞水平或分子水平的生態(tài)學(xué)[1]。人體體表和體腔存在大量的微生物種群，它們分別定植于胃腸道、口腔、皮膚、呼吸道、泌尿道等，與其生存的微環(huán)境共同構(gòu)成人體微生態(tài)系統(tǒng)[2]。

目前的微生態(tài)研究主要集中于胃腸道系統(tǒng)，隨著近年來的逐步深入，人們逐漸意識到皮膚微生態(tài)的變化可能會導(dǎo)致皮膚出現(xiàn)問題甚至疾病[3]。皮膚表面具有多種菌群，通?？梢苑譃槌ｑv菌和暫住菌[4]。暫住菌通過接觸外界環(huán)境獲得，常常會引起皮膚感染；常駐菌是在健康皮膚表面定居的微生物，具有多種調(diào)節(jié)功能[4-5]。常駐菌可以通過調(diào)控皮膚角質(zhì)形成細胞表達抗菌肽來抵御外界病原菌在皮膚表面的生長[5]，可以直接分泌抗菌肽抑制病原菌定植[6]，可以分解角質(zhì)細胞的碎屑或脂質(zhì)，維持表皮的酸性環(huán)境，有效地抵御外界病原菌的入侵[7]，可以間接調(diào)節(jié)機體免疫反應(yīng)[8]。

桂林市黃洛瑤寨地區(qū)人群在洗發(fā)過程中長期使用淘米水發(fā)酵液，對發(fā)質(zhì)和頭發(fā)根部頭皮具有良好的養(yǎng)護作用，為了深入研究發(fā)酵淘米水中菌株對頭發(fā)和頭皮微生態(tài)的影響，對淘米水發(fā)酵液進行菌株的分離與鑒定，得到3株嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)疑似菌株，通過菌株的菌落形態(tài)、顯微形態(tài)、生理生化試驗、分子生物學(xué)試驗進行鑒定。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

淘米水發(fā)酵液，來源于廣西壯族自治區(qū)桂林市龍勝縣龍脊鎮(zhèn)金江村黃洛瑤寨(長發(fā)村)。

LBS瓊脂培養(yǎng)基[9]，MRS培養(yǎng)基[9]，營養(yǎng)瓊脂(NA)培養(yǎng)基[9]，沙氏瓊脂(SDA)培養(yǎng)基[10]，MC培養(yǎng)基[11]。

DNA快速提取試劑(PrepMan Ultra)、瓊脂糖、PCR試劑(Taq酶，10×Taq Buffer(Mg2+)，dNTP Mixture，rTaqDNA polymerase，重蒸水等)、ExoSAP-IT PCR產(chǎn)物純化試劑盒、測序試劑(BigDye Terminator，5×Sequencing Buffer)、BigDye XTerminator Purification Kit純化試劑盒、革蘭氏染色液，Invitrogen公司；莫匹羅星鋰、半胱氨酸鹽酸鹽，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗設(shè)備

Eppendorf Research plus移液器(1 000 μL、200 μL 、100 μL、10 μL)、Eppendorf MixMate渦旋振蕩器、Centrifuge5810R型離心機，Eppendorf公司； PowerPac Basic電泳儀、VersaDoc MP 4000 型凝膠成像儀，Bio-Rad公司；Veriti 96 Well Thermal Cycler PCR儀，Thermo Fisher公司；AB3500、AB3130型基因分析儀，ABI公司；DM2500型光學(xué)顯微鏡，Leica公司；Esco AC2-4S1型二級生物安全柜，Esco公司；DHP-9272B型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；AW 300SG型厭氧培養(yǎng)箱，ELECTROTEK公司；HPP260型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，MEMMERT公司；BD Phoenix 100型全自動微生物檢定儀，BD公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株的分離純化

將淘米水發(fā)酵液進行梯度稀釋，將冷卻至約50 ℃的LBS瓊脂培養(yǎng)基倒入滅菌后的培養(yǎng)皿中，待其凝固，待用。取1.0 mL合適稀釋度的稀釋液置于LBS固體培養(yǎng)基上涂勻，37 ℃厭氧培養(yǎng)36～48 h。

在LBS瓊脂平板上，挑取具有乳酸菌典型特點并且生長旺盛的單菌落，通過革蘭染色后，挑取含有革蘭陽性菌的單菌落在LBS瓊脂平板上再次進行劃線培養(yǎng)，37 ℃厭氧培養(yǎng)36～48 h，重復(fù)分離純化培養(yǎng)至少3次。

在MRS瓊脂平板上劃線分離純化革蘭陽性菌單菌落，37 ℃厭氧培養(yǎng)36～48 h，重復(fù)操作3～5次，直到獲得單菌株的純培養(yǎng)物。將該菌株進行斜面劃線培養(yǎng)，4 ℃保藏備用。

1.3.2 菌株生理生化鑒定

將樣品原液用生理鹽水10倍系列稀釋成10-7～10-1個/mL樣品稀釋液，各取1 mL樣品稀釋液分別注入到滅菌的90 mm平皿內(nèi)，分別將NA培養(yǎng)基、SDA培養(yǎng)基、MC培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、莫匹羅星鋰鹽和半胱氨酸鹽酸鹽改良MRS培養(yǎng)基(以下簡稱“改良MRS”)傾注到平皿內(nèi)，每皿15 mL，搖勻，每個稀釋度2個平行。NA培養(yǎng)基置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h，SDA培養(yǎng)基置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72 h，MC培養(yǎng)基置于36 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72 h，MRS培養(yǎng)基和改良MRS培養(yǎng)基置于厭氧罐中，36 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72 h。

根據(jù)各培養(yǎng)基上生長的菌落特征進行革蘭氏染色鏡檢并計數(shù)，并根據(jù)鏡檢結(jié)果將菌落在培養(yǎng)基上進行分離純化至3 代，應(yīng)用全自動微生物鑒定儀對3 代純菌種進行46種生化試驗，充分對微生物進行菌屬識別(ID)分析。

1.3.3 菌株分子生物學(xué)鑒定

提取分離菌株的基因組DNA，該菌株基因組DNA為模板，擴增其16S rDNA基因片段。PCR反應(yīng)體系為：10×Buffer(Mg2+)2.5 μL，dNTP Mixture(各 2 mmol/L)2 μL，上游引物(25 μmol/L)1 μL，下游引物(25 μmol/L)1 μL，rTaqDNA polymerase(5 U/μL)0.2 μL，

DNA模版 2 μL，補足重蒸水至終體積25 μL。

PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min預(yù)變性，94 ℃ 45 s變性，33 ℃ 30 s退火，72 ℃ 1 min延伸，30個循環(huán)，72 ℃ 10 min延伸。引物序列上游引物F：5′-T￣T￣G￣A￣T￣C￣T￣G￣G￣A￣T￣T￣A￣C￣C￣G￣C￣G￣G￣C-3′，下游引物R：5′-A￣G￣G￣G￣T￣A￣T￣C￣T￣A￣A￣T￣A￣C￣T￣C￣C￣T￣A￣C-3′。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的分離純化

用LBS 培養(yǎng)基從淘米水發(fā)酵液中共分離純化得到5株具有乳酸菌典型特點的菌株，其中3株菌株為革蘭氏陽性菌，可作為嗜酸乳桿菌疑似菌株，編號為1-3，3株乳桿菌疑似菌株菌落形態(tài)見表1，菌株放大1000倍后顯微形態(tài)見圖1。

表1 菌株菌落形態(tài)及革蘭氏染色結(jié)果

圖1 菌株顯微形態(tài)(1 000倍放大)Fig.1 Microscopic morphology of three bacterial strains(×1 000)

2.2 菌株生理生化鑒定

通過對3株嗜酸乳桿菌疑似菌株進行46項生理生化試驗，結(jié)果見表2。

由表2可初步確定3號菌株與嗜酸乳桿菌的生理生化指標相近，其鑒定可信度達到90%。

表2 3號菌株46種生理生化鑒定結(jié)果

2.3 菌株分子生物學(xué)鑒定

細菌rRNA(核糖體RNA)按沉降系數(shù)分為3種，分別為5S rRNA、16S rRNA和23S rRNA。16S rDNA是細菌染色體上編碼16S rRNA相對應(yīng)的DNA序列。16S rDNA由于大小適中，既能體現(xiàn)不同菌屬之間的差異，又能利用測序技術(shù)較容易地得到其序列[12-13]。在 16S rRNA 分子中，可變區(qū)序列因細菌不同而異，恒定區(qū)序列基本保守，所以可利用恒定區(qū)序列設(shè)計引物，將16S rDNA片段擴增出來，利用可變區(qū)序列的差異來對不同菌屬、菌種的細菌進行分類鑒定[14-15]。

將3號菌株進行16S rDNA測序，其序列如下。

5′-T￣G￣C￣T￣G￣G￣C￣A￣C￣G￣T￣A￣G￣T￣T￣A￣G￣C￣C￣G￣T￣G￣A￣C￣T￣T￣T￣C￣T￣G￣G￣T￣T￣G￣A￣T￣T￣A￣C￣C￣G￣T￣C￣A￣A￣A￣T￣A￣A￣A￣G￣G￣C￣C￣A￣G￣T￣T￣A￣C￣T￣A￣C￣C￣T￣C￣T￣A￣T￣C￣C￣T￣T￣C￣T￣T￣C￣A￣C￣C￣G￣A￣C￣A￣A￣C￣A￣G￣A￣G￣C￣T￣T￣T￣A￣C￣G￣A￣T￣C￣C￣G￣A￣A￣A￣A￣C￣C￣T￣T￣C￣T￣T￣C￣A￣C￣T￣C￣A￣C￣G￣C￣G￣G￣C￣G￣T￣T￣G￣C￣T￣C￣C￣A￣T￣C￣A￣G￣A￣C￣T￣T￣G￣C￣G￣T￣C￣C￣A￣T￣T￣G￣T￣G￣G￣A￣A￣G￣A￣T￣T￣C￣C￣C￣T￣A￣C￣T￣G￣C￣T￣G￣C￣C￣T￣C￣C￣C-3′。

將測序結(jié)果用 BLAST進行序列比對，結(jié)果表明該菌株與GenBank中發(fā)表的嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)同源性為 99%?？梢?號菌株與嗜酸乳桿菌同源性較強，鑒定該菌株為嗜酸乳桿菌，命名為CFC-001。

嗜酸乳桿菌具有多種益生功效，包括調(diào)節(jié)腸道菌群失調(diào)，通過殺菌和競爭附著位點的作用抑制病原菌的滋生和入侵，調(diào)節(jié)免疫力,延緩機體衰老等作用[16]。

目前桂林市黃洛瑤寨地區(qū)人群在洗發(fā)過程中長期使用淘米水發(fā)酵液，不使用任何洗發(fā)水和護發(fā)素，該地區(qū)發(fā)質(zhì)和頭發(fā)根部頭皮質(zhì)量都要優(yōu)于其他地區(qū)。經(jīng)過本實驗篩選后發(fā)現(xiàn)該淘米水發(fā)酵液中嗜酸乳桿菌的菌落總數(shù)達到3.8×107CFU/mL，是該體系中的優(yōu)勢菌群之一，所以認為嗜酸乳桿菌可以對頭發(fā)和頭皮的微生態(tài)產(chǎn)生積極的影響，可以有效養(yǎng)護頭發(fā)與頭皮，但是作用機制尚不明確，需進行進一步的研究。

3 結(jié)論

從淘米水發(fā)酵液中分離得到3株嗜酸乳桿菌疑似菌株，通過菌株菌落形態(tài)、顯微形態(tài)、革蘭氏染色、46項生理生化指標和分子生物學(xué)鑒定方法，綜合確定其中一株菌為嗜酸乳桿菌，并且命名為CFC-001。