于翠芳，王 鵬，朱英蓮

(青島農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院,山東 青島 266109)

乳酸菌是能發(fā)酵糖類、主要代謝產(chǎn)物為乳酸的一類革蘭氏陽性菌，廣泛存在于各類食品中。乳酸菌在生長發(fā)酵過程中能產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，利用這一特點，乳酸菌在一定程度上能起到食品保鮮功能[1]。乳酸菌代謝過程中產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)——乳酸菌素，是起抑菌作用的最重要活性物質(zhì)[2]。，是乳酸菌代謝過程中合成并分泌到環(huán)境中的一類對同種或親緣關(guān)系較近的菌株有抑制作用的殺菌蛋白或多肽物質(zhì)，具有高效、無毒、無副作用、對環(huán)境無污染等優(yōu)點，可有效抑制或殺死食品中產(chǎn)生的病原菌和腐敗菌[3-7]。同時，乳酸菌素易被人體消化道的部分蛋白酶分解，且不會在人體內(nèi)蓄積而引起不良反應(yīng)，因此被認為是一種具有廣闊應(yīng)用前景的天然食品防腐劑、飼料添加劑和新的抑菌藥物。因此乳酸菌素將在人類疾病防治、動物醫(yī)藥保健及食品防腐等方面體現(xiàn)巨大的應(yīng)用潛力[8-9]。近年來國內(nèi)外許多學者研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌細菌素不僅能抑制近源菌株的生長，還可抑制其他菌株的生長[10-11]。

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是兼性厭氧的革蘭氏陽性菌，是醫(yī)療感染和食品中最常見的病原體之一，由其引起的食物中毒已成為世界性的公共衛(wèi)生問題[12]。本研究中，筆者從發(fā)酵食品中分離7株乳酸菌，研究其對金黃色葡萄球菌的抑菌效果，以期為金黃色葡萄球菌的防制提供一定的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

從發(fā)酵食品中分離的乳酸菌的乳酸菌株A、B、a、b、c、d及e，保藏于青島農(nóng)業(yè)大學發(fā)酵工程實驗室。

金黃色葡萄球菌，購于中國普通微生物菌種保藏中心，編號為1.8721。

MRS肉湯及MRS固體培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂及營養(yǎng)肉湯，青島海博生物技術(shù)有限公司。

NaCl、鹽酸、NaOH、乳酸等(分析純)，天津市北方天醫(yī)化學試劑廠。

1.2 方法

1.2.1 指示菌的活化

挑取在斜面培養(yǎng)基上保存的金黃色葡萄球菌菌苔分別接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的斜面上，在37 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)24 h，然后在4 ℃條件下保存菌種，備用。

1.2.2 具有金黃色葡萄球菌抑菌活性的乳酸菌的篩選

1)乳酸菌種子液及發(fā)酵上清液的制備

挑取斜面培養(yǎng)基上的乳酸菌菌苔接種到10 mL MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，作為種子液，備用。取種子液0.5 mL接種于50 mL MRS液體培養(yǎng)基中，振蕩均勻，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h后，在4 ℃條件下10 000 r/min離心10 min，取上清液備用。

2)乳酸菌對指示菌的抑菌實驗

挑取1環(huán)活化保存的指示菌，接種于裝有生理鹽水的試管中，振蕩均勻，在凝固冷卻的營養(yǎng)瓊脂平板中央滴加0.1 mL金黃色葡萄球菌的菌懸液，用涂布棒涂布均勻，靜置30 min。用滅過菌的內(nèi)徑為12 mm的打孔器在涂布后的培養(yǎng)基上打孔，每個平板需等距離地打3個孔。分別取0.15 mL乳酸菌發(fā)酵液接入打出的小孔中，將平板放于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。觀察抑菌效果，測量并記錄抑菌圈的直徑大小。

3)乳酸對抑菌效果的影響

將乳酸標準液分別接入不同的MRS液體培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)pH與每株乳酸菌發(fā)酵上清液的pH相同，分別進行抑菌實驗。37 ℃培養(yǎng)24 h后，觀察實驗結(jié)果，測量并記錄每株乳酸菌發(fā)酵上清液及乳酸標準液的抑菌圈直徑大小。

4)乳酸菌發(fā)酵液對抑菌效果的影響

分別取2、4、6、8和10 mL乳酸菌發(fā)酵上清液加入到98 、96、94、92和90 mL的MRS液體培養(yǎng)基中，配成2%、4%、6%、8%和10%的乳酸菌發(fā)酵上清液液，進行抑菌效果的實驗。37 ℃培養(yǎng)24 h后，觀察實驗結(jié)果，測量并記錄每株乳酸菌不同濃度菌液的抑菌圈直徑大小。

5)初始pH對乳酸菌抑菌效果的影響

用1 mol/L的鹽酸和NaOH溶液將MRS液體培養(yǎng)基的pH分別調(diào)節(jié)至4、5、6、7和8，分別取0.5 mL種子液接入調(diào)好pH的50 mL MRS液體培養(yǎng)基中，放于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，進行抑菌效果的實驗。37 ℃培養(yǎng)24 h后，觀察實驗結(jié)果，測量并記錄每株乳酸菌不同pH條件下的抑菌圈直徑大小。

6)發(fā)酵時間對乳酸菌抑菌效果的影響

取種子液0.5 mL接入50 mL MRS液體培養(yǎng)基中，分別取培養(yǎng)時間為12、24、48和72 h的乳酸菌上清液進行抑菌效果的實驗。37 ℃培養(yǎng)24 h后，觀察實驗結(jié)果，測量并記錄每株乳酸菌不同發(fā)酵時間的抑菌圈直徑大小。

7)處理溫度對乳酸菌抑菌效果的影響

將乳酸菌發(fā)酵上清液放在60、80和100 ℃的條件下處理30 min，進行抑菌效果的實驗。37 ℃培養(yǎng)24 h后，觀察實驗結(jié)果，測量并記錄每株乳酸菌不同溫度條件下的抑菌圈直徑大小。

2 結(jié)果與討論

2.1 乳酸菌抑菌效果的初步測定

利用筆者所在實驗室分離保存的7株乳酸菌分別對金黃色葡萄球菌進行抑菌實驗，結(jié)果如表1所示。

由表1可知，這7株菌對金黃色葡萄球菌都有一定的抑菌效果。其中，菌株B的抑菌效果最好，菌株a的抑菌效果最差。菌株A、B、b和e對金黃色葡萄球菌的抑菌效果明顯優(yōu)于其他幾種指示菌。因此，后續(xù)實驗采用抑菌效果較好的菌株A、B、b和e進一步研究。榮鳳君[13]從4種發(fā)酵食品中篩選出了11株具有抑菌作用的乳酸菌，其中有4株對金黃色葡萄球菌具有較好的抑菌效果；胡彥新等[14]從傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品中分離出了63株乳酸菌，其中有2株對金黃色葡萄球菌有較明顯的抑制能力。

表1 不同菌株的抑菌效果

注：D為抑菌圈直徑，d為打孔圈直徑。

2.2 乳酸菌發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌抑制效果

2.2.1 乳酸對抑菌效果的影響

考察4株乳酸菌發(fā)酵液及乳酸標準溶液對金黃色葡萄球菌的抑菌效果，結(jié)果如圖1所示。

圖1 乳酸及乳酸菌發(fā)酵液對抑菌效果的影響Fig.1 Effects of lactic acid and lactobacillus fermented broth on bacteriostatic effect

由圖1可以看出：乳酸溶液對金黃色葡萄球菌有一定的抑菌效果，但是4株乳酸菌的抑菌效果顯著大于純?nèi)樗岬囊志Ч?P<0.05)，說明在乳酸菌發(fā)酵液中，除了乳酸外，還存在其他的抑菌物質(zhì)，推測為乳酸菌素。郗恩光等[15]通過調(diào)節(jié)發(fā)酵上清液的pH來消除乳酸對抑菌效果的影響，而本研究是通過純品的乳酸作為對照來排除其影響。

2.2.2 乳酸菌發(fā)酵液用量對抑菌效果的影響

考察4株乳酸菌發(fā)酵液體積分數(shù)對金黃色葡萄球菌抑菌效果的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 發(fā)酵液濃度對抑菌效果的影響Fig.2 Effects of fermentation concentration on bacteriostatic effect

由圖2可看出：在一定體積分數(shù)范圍內(nèi)，隨著乳酸菌發(fā)酵液用量的增大，抑菌效果呈逐漸增強的趨勢，在設(shè)置的5個梯度中，菌株b在的發(fā)酵液體積分數(shù)為6%時，抑菌效果達到最大值，而菌株A、B和e的發(fā)酵液的體積分數(shù)為10%時的抑菌效果最佳。由此可看出，菌株b的發(fā)酵液在低濃度時即能達到較好的抑菌效果，隨著濃度的繼續(xù)增大，抑菌效果基本不發(fā)生變化。

2.2.3 初始pH對抑菌效果的影響

考察不同初始pH條件下，4株乳酸菌發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌的抑制效果，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同初始pH對抑菌效果的影響Fig.3 Effects of initial pH on bacteriostatic effect

由圖3可知：在初始pH為6左右時培養(yǎng)的4株菌，它們的發(fā)酵液抑菌效果最好；在pH<6的情況下，每株菌的抑菌效果隨著pH的增大而增強；在pH>6的情況下，抑菌效果隨著pH的增大而減弱。這可能是這4株乳酸菌在pH為6左右生長最好，產(chǎn)生了大量的乳酸及具有抑菌能力的生物活性物質(zhì)。其中，初始pH 在3～7時，菌株e的生長不受影響，而且它的發(fā)酵液有較好的抑菌效果，說明該菌株對初始pH的要求比較寬泛。

2.2.4 發(fā)酵時間對抑菌效果的影響

考察不同發(fā)酵時間對4株乳酸菌的發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌的抑菌效果，結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同發(fā)酵時間對抑菌效果的影響Fig.4 Effects of fermentation time on bacteriostatic effect

由圖4可看出：4株菌株在24 h后抑菌效果趨于穩(wěn)定，隨著培養(yǎng)時間的延長，抑菌效果增強緩慢，它們在發(fā)酵48 h時的發(fā)酵液，對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好，并且培養(yǎng)時間超過48 h后，隨著培養(yǎng)時間的延長，抑菌效果基本不變。這說明，發(fā)酵液在不同的發(fā)酵時間，會產(chǎn)生不同的抑菌效果，培養(yǎng)時間48 h，這4株菌的發(fā)酵液中抑菌活性物質(zhì)的抑菌效果即可達到最好。趙藝竹等[16]的研究表明，隨著發(fā)酵時間延長，乳酸片球菌LAB12發(fā)酵上清液抑菌作用增強，22 h時抑菌效果達到最大且趨于穩(wěn)定；而植物乳桿菌LAB19在發(fā)酵約10 h后，抑菌效果基本保持不變。因此，發(fā)酵時間對抑菌效果有較大的影響。

2.2.5 處理溫度對乳酸菌發(fā)酵液抑菌效果的影響

考察不同溫度條件下處理后的4株乳酸菌的發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌的抑菌效果，結(jié)果如圖5所示。

圖5 處理溫度對抑菌效果的影響Fig.5 Effects of processing temperature on bacteriostatic effect

由圖5可知：5株乳酸菌發(fā)酵液在60和80 ℃處理30 min后，仍然具有較好的抑菌效果，且60 ℃處理后的抑菌效果要優(yōu)于80 ℃處理后的抑菌效果。在100 ℃處理30 min后，失去抑菌效果，說明100 ℃高溫處理會使乳酸菌素遭到破壞，在80 ℃以下這4株乳酸菌的抑菌效果較穩(wěn)定，即在巴氏殺菌的溫度范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好，有潛力應(yīng)用于食品中。

3 結(jié)論

以從發(fā)酵食品中分離的7株乳酸菌為對象，研究其對金黃色葡萄球菌的抑菌效果，結(jié)果表明，菌株A、B、b及e的抑菌效果較好。通過乳酸實驗表明，發(fā)酵液中含有除乳酸之外的抑菌成分，最佳發(fā)酵條培養(yǎng)時間為37 ℃、靜置培養(yǎng)48 h。在一定濃度范圍內(nèi)，隨著乳酸菌發(fā)酵液濃度的增大，抑菌效果呈逐漸增強的趨勢。4株菌能在較寬的初始發(fā)酵pH范圍內(nèi)保持活性，且具有較好的溫度穩(wěn)定性。因此，這4株乳酸菌的發(fā)酵產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌有良好的抑菌作用，可進一步對其中的生物活性物質(zhì)進行分離純化，為抑制金黃色葡萄球菌天然防腐劑開發(fā)與利用提供一定的研究基礎(chǔ)。