苗欣宇，牛紅紅，李 達(dá)，鄭 麗，遲燕平，蘇 穎，劉佳彤，王景會(huì)

（吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，吉林長春 130033）

0 引言

紅酵母，屬于隱球酵母科[1]。其發(fā)酵產(chǎn)物中含有β-胡蘿卜素[2]、紅酵母紅素[3]和γ-胡蘿卜素[4]等多種類胡蘿卜素成分，在發(fā)酵過程中分解大分子蛋白質(zhì)和糖類化合物。類胡蘿卜素是一類黃色或紅色的多烯類化合物，均有抗氧化性[5]，能有效抑制細(xì)胞中生物大分子被自由基損害，起到抗衰老、提高免疫能力的作用。有研究證明，類胡蘿卜素可以保護(hù)細(xì)胞、抑制慢性退行性疾病的發(fā)生，以及抑制正常體細(xì)胞的變異、腫瘤細(xì)胞的生長，并且在促進(jìn)兒童身體發(fā)育方面有重要作用[6]。然而，人體和動(dòng)物體內(nèi)不能自主合成類胡蘿卜素，只能從食物中攝取，已經(jīng)有很多國家允許類胡蘿卜素添加劑用作食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑、飼料增色劑[7]等。

近年來，國內(nèi)對紅酵母屬的研究越來越豐富，尤其是紅酵母的發(fā)酵工藝和發(fā)酵產(chǎn)物的活性成分研究頗多。趙笛[8]通過優(yōu)化酸熱破壁條件對紅酵母細(xì)胞進(jìn)行破壁，最終使蝦青素的提取率達(dá)到911.6 μg/g，并研究向培養(yǎng)基投放前體物質(zhì)對菌體生長及色素積累的影響。Tapingkae W等人[9]在雞飼料中添加紅酵母，酵母補(bǔ)充組的蛋黃顏色變深，HMG-CoA還原酶活性顯著降低，降低了血清和蛋黃中的膽固醇含量。紅酵母發(fā)酵可以增加飼料中的類胡蘿卜素，增強(qiáng)抗氧化能力，可增強(qiáng)機(jī)體的免疫能力，提高禽蛋的品質(zhì)和風(fēng)味[10]，并可以改善肉雞的腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)及提高肉雞生產(chǎn)性能和屠體性能[11]。此外，新疆的哈薩克族牧民在用駱駝乳生產(chǎn)酸駱駝乳中可以分離出一株紅酵母，其可以增加駱駝乳中的營養(yǎng)價(jià)值，并起到抗菌、抑霉的作用[12]。

試驗(yàn)以農(nóng)林廢棄物，豆粕、麩皮和酒糟混合制成固體培養(yǎng)基，利用從土壤中篩選出的一株紅酵母CCYZ116進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵。經(jīng)過紅酵母的發(fā)酵，研究固體培養(yǎng)基中的類胡蘿卜素含量、可溶性蛋白含量和可溶性糖含量的變化，進(jìn)一步為農(nóng)林廢棄物回收再利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅酵母，吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品微生物實(shí)驗(yàn)室在吉林省長春市凈月區(qū)的土壤中分離鑒定提供，并保藏命名為CCYZ116。

斜面培養(yǎng)基：200 g/L馬鈴薯，20 g/L葡萄糖，20 g/L瓊脂。

液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：10 g/L蛋白胨，10 g/L酵母浸粉，40 g/L葡萄糖。裝液量為50 mL于250 mL三角瓶中。

固態(tài)培養(yǎng)基：將酒糟、豆粕和麩皮研磨至40目，酒糟∶豆粕∶麩皮配比為1∶3∶2，按比例稱好培養(yǎng)基，均勻攪拌，分別取50 g置于500 mL燒杯中，封口包扎，于121℃下滅菌40 min[13]。

1.2 儀器與設(shè)備

MLS-3780型高壓蒸汽滅菌鍋，日本Sanyo公司產(chǎn)品；HZQ-X100型全溫振蕩培養(yǎng)箱、DHP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司產(chǎn)品；Cary 300型紫外可見光分光光度計(jì)，美國Varian公司產(chǎn)品；Evolution RC型高速冷凍離心機(jī)，美國Thermo Stovall公司產(chǎn)品；DL-CJ-2ND型超級潔凈工作臺，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 種子培養(yǎng)

CCYZ116種子培養(yǎng)：在CCYZ116斜面上挑取菌落，接種于液體培養(yǎng)基中。溫度為30℃，以轉(zhuǎn)速230 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。

接種量不同處理：

（1） 空白組。接入15 mL滅菌蒸餾水為空白對照，于30℃下培養(yǎng)72 h。

（2） 原液培養(yǎng)組。將15 mL CCYZ116液體發(fā)酵液離心，棄上清，用15 mL滅菌蒸餾水水重懸接入固體培養(yǎng)基中，于30℃下培養(yǎng)72 h。

（3） 2.5倍濃縮培養(yǎng)組。將37.5 mL CCYZ116液體發(fā)酵液離心，棄上清，用15 mL的滅菌蒸餾水水重懸接入固態(tài)培養(yǎng)基，于30℃下培養(yǎng)72 h。

（4） 5倍濃縮培養(yǎng)組。將75 mL CCYZ116液體發(fā)酵液離心，棄上清，用15 mL的滅菌蒸餾水水重懸接入固態(tài)培養(yǎng)基，于30℃下培養(yǎng)72 h。

1.3.2 有效活菌數(shù)的測定

采用平板計(jì)數(shù)法測定有效菌數(shù)，每個(gè)發(fā)酵燒杯攪拌均勻，取5 g加入50 mL無菌水，于搖床中以轉(zhuǎn)速230 r/min振蕩搖勻30 min，制成CCYZ116懸液。取稀釋至10-4，10-5，10-6倍的菌懸液100 μL于斜面培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)48 h，對長有30～300個(gè)菌落的平板計(jì)數(shù)。單位：CFU/g。

1.3.3 生物量檢測方法

將5倍于培養(yǎng)物質(zhì)量的無菌蒸餾水加入到發(fā)酵杯中，分次洗滌。用4層紗布依次濾掉雜質(zhì)，得到菌液。將菌液以轉(zhuǎn)速3 500 r/min離心15 min，得到濕菌體。將CCYZ116菌體移至預(yù)先干燥至恒質(zhì)量的稱量杯中，于50℃下烘干至恒質(zhì)量，用分析天平稱量CCYZ116菌體總質(zhì)量[14]。

CCYZ116菌體生物量計(jì)算公式：

式中：W——CCYZ116菌體生物量，g/L；

M——稱量瓶與菌體的總質(zhì)量，g；

M0——稱量瓶的質(zhì)量，g；

V——所取濾液量，mL，一般取10 mL。

1.3.4 類胡蘿卜素的測定方法

采用酸熱破壁法[15]。在上述1.3.3方法獲得的濕菌體10 mL中加入10 mL的3 mol/L HCl溶液。將酸溶液在室溫下振蕩浸泡45 min，沸水浴煮沸4～5 min后迅速冷卻。

酸熱破壁后的CCYZ116酸溶液，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心15 min，沉淀用無菌蒸餾水反復(fù)洗滌2次，加入10 mL丙酮。丙酮溶液于室溫下振蕩1 h提取類胡蘿卜素后，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心15 min，得到上清液即為類胡羅卜素提取液。如若離心的沉淀還有顏色殘留，則說明細(xì)胞碎片中仍有色素未提取出，可再加丙酮再提取。用分光光度計(jì)測定適當(dāng)稀釋后的浸提液于波長450 nm下的吸光度[16]。類胡蘿卜素含量計(jì)算公式為：

式中：Wc——發(fā)酵液類胡蘿卜素含量，μg/g；

Amax——最大吸收波長450 nm下的吸光度；

D——測定試樣的稀釋倍數(shù)；

V——提取色素用有機(jī)溶劑體積，mL；

m——干酵母菌體質(zhì)量，g；

0.16——類胡蘿卜素的摩爾消光系數(shù)。

類胡蘿卜素產(chǎn)量計(jì)算公式：

類胡蘿卜素產(chǎn)量（μg/L） =Wc×W.

式中：Wc——發(fā)酵液類胡蘿卜素含量，μg/g；

W——CCYZ116菌體生物量，g/L。

1.3.5 可溶性蛋白含量檢測方法

采用凱氏定氮法測定[17]。

1.3.6 可溶性糖含量檢測方法

采用苯酚濃硫酸法測定[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同接種量對活菌數(shù)和菌體生物量的影響

不同接種量對活菌數(shù)和菌體生物量的影響見表1。

表1 不同接種量對活菌數(shù)和菌體生物量的影響

由表1可知，5倍濃縮組的培養(yǎng)基中的活菌數(shù)最高達(dá)到了3.64×108CFU/g，菌體生物量最高達(dá)到2.644 g/L；2.5倍濃縮組的活菌數(shù)為3.60×108CFU/g，菌體生物量最高達(dá)到了2.699 g/L，兩組之間沒有顯著差異。但與原液培養(yǎng)組和空白組比較差異顯著（p＜0.05）。結(jié)果表明，接種量的增加，顯著提高了培養(yǎng)基的活菌數(shù)量和菌體生物量，但濃縮倍數(shù)達(dá)到2.5倍時(shí)對活菌數(shù)量和菌體生物量的影響已飽和，不是接菌量越大活菌數(shù)量就越高。在實(shí)際發(fā)酵應(yīng)用中可適當(dāng)加大接菌量，達(dá)到飽和點(diǎn)后無需再繼續(xù)加大接菌量，既可提高發(fā)酵效率，又能降低成本。

2.2 不同接種量對類胡蘿卜素含量的影響

不同接種量的CCYZ116固態(tài)發(fā)酵飼料，對發(fā)酵產(chǎn)物中類胡蘿卜素含量的影響。

不同接種量對類胡蘿卜素含量的影響見圖1，不同接種量對類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響見圖2。

由圖1可知，5倍濃縮組的類胡蘿卜素含量最高達(dá)到了713.22 μg/g，類胡蘿卜素產(chǎn)量最高，達(dá)到了1 312.3 μg/L。與2.5倍濃縮組、原液培養(yǎng)組和空白組相比，均顯著提高了發(fā)酵產(chǎn)物中的類胡蘿卜素含量和產(chǎn)量 （p＜0.05）。

接種量的不同影響著酵母的生長和發(fā)酵產(chǎn)物組分，適宜的接種量可以促進(jìn)CCYZ116菌體生長，增加菌體生物量。但是，菌體生長的最適接種量與類胡蘿卜素產(chǎn)量的最適接種量不同。王蓉等人[19]研究表明，紅酵母WP3生長和類胡蘿卜素產(chǎn)量最高的發(fā)酵條件是不同的。發(fā)酵過程中，影響CCYZ116菌體生長和類胡蘿卜素產(chǎn)量的因素還不明確，需要進(jìn)一步研究探討。

類胡蘿卜素可在植物、動(dòng)物和微生物的生長繁殖過程中起到關(guān)鍵的作用。目前，生產(chǎn)應(yīng)用中80%～90%的類胡蘿卜素是通過化學(xué)合成的，市場上對于天然的類胡蘿卜素的需求量與日俱增。農(nóng)林廢棄物經(jīng)過紅酵母CCYZ116的發(fā)酵產(chǎn)生了大量的天然類胡蘿卜素，豐富了其營養(yǎng)成分。經(jīng)過發(fā)酵的農(nóng)林廢棄物，可制作增色飼料，用于水產(chǎn)養(yǎng)殖和家禽養(yǎng)殖等[20-21]。

圖1 不同接種量對類胡蘿卜素含量的影響

圖2 不同接種量對類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響

2.3 不同接種量對可溶性蛋白和可溶性總糖含量的影響

不同接種量對可溶性總糖含量的影響見圖3。

圖3 不同接種量對可溶性總糖含量的影響

由圖3可知，2.5倍與5倍濃縮組的可溶性總糖含量分別達(dá)到了5.433，5.309 g/100 g，與原液培養(yǎng)和空白組相比顯著提高了飼料中的可溶性總糖含量（p＜0.05）。然而2.5倍濃縮組與5倍濃縮組之間沒有顯著性差異。說明2.5倍的接種量使培養(yǎng)基中可溶性蛋白達(dá)到了閾值，在實(shí)際應(yīng)用中無需5倍接種量，以節(jié)省成本。

經(jīng)韓梅等人[22]對紅酵母發(fā)酵產(chǎn)物中類胡蘿卜素、蛋白質(zhì)和脂肪酸的成分進(jìn)行分析，表明經(jīng)過紅酵母的發(fā)酵后，培養(yǎng)基產(chǎn)生更豐富的氨基酸和脂肪酸，提高培養(yǎng)基的營養(yǎng)價(jià)值。

不同接種量對可溶性蛋白含量的影響見圖4。

圖4 不同接種量對可溶性蛋白含量的影響

由圖4可知，2.5倍濃縮、5倍濃縮組和原液培養(yǎng)組，與空白組相比，均顯著提高了可溶性蛋白含量（p＜0.05）。原液組的可溶性蛋白含量最高達(dá)到了10.392 g/100 g，顯著地提高了可溶性蛋白含量（p＜0.05）。說明原液組的接種量在發(fā)酵過程中培養(yǎng)基中可溶性蛋白含量最高，接種量的增加反而會(huì)降低可溶性蛋白含量，這種結(jié)果產(chǎn)生的原因和機(jī)制需進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

利用從土壤中分離出一株紅酵母的發(fā)酵作用來增加農(nóng)林廢棄物的營養(yǎng)成分。研究不同接種量的CCYZ116固態(tài)發(fā)酵后農(nóng)林廢棄物培養(yǎng)基中菌體生長和營養(yǎng)成分的變化。2.5倍濃縮組與空白組、原液組相比顯著地提高了培養(yǎng)基中活菌數(shù)（3.64×108CFU/g）和生物量（2.699 g/L，p＜0.05）。5倍濃縮組的類胡蘿卜素含量 （713.22 μg/g） 和產(chǎn)量 （1 312.3 μg/L） 最高，2.5倍濃縮組的可溶性總糖最高達(dá)5.433 g/100 g，原液組的可溶性蛋白含量最高為10.392 g/100 g（p＜0.05）。

由此可見，提高紅酵母的接種量，有助于提高紅酵母發(fā)酵產(chǎn)物的營養(yǎng)價(jià)值、提高發(fā)酵效率、降低成本，為農(nóng)林廢棄物回收利用和紅酵母實(shí)際應(yīng)用的進(jìn)一步研究和開發(fā)提供了理論依據(jù)。