代金鳳，羅 雯，廖作敏，羅 政，文春平，許 艷，吳正云，周山大慶，張文學(xué)，4*

（1.四川大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都 610065；2.四川省古川酒業(yè)有限公司，四川 邛崍 611530；3.日本國立明石工業(yè)高等專門學(xué)校，兵庫 明石674-8501；4.四川大學(xué) 錦江學(xué)院白酒學(xué)院，四川 眉山 620860）

濃香型白酒質(zhì)量與白酒的品質(zhì)有密切關(guān)系，窖泥的性狀通常由經(jīng)驗豐富的工作人員根據(jù)窖泥的感官性狀以及窖池的產(chǎn)酒率和優(yōu)品率進行判斷，缺乏科學(xué)依據(jù)，且由微生物引起的窖泥的感官變化具有延滯性，不能及時呈現(xiàn)窖泥性狀的變化。以己酸為前體物質(zhì)的己酸乙酯是濃香型白酒中最重要的香氣成分，在已有的文獻報道中，克氏梭菌（Clostridium kluyveri）是濃香型白酒中主要的產(chǎn)己酸微生物之一[1-4]，因此對窖泥中克氏梭菌以及己酸循環(huán)系統(tǒng)中關(guān)鍵基因的表達量研究，對實現(xiàn)科學(xué)養(yǎng)窖護窖，提高白酒品質(zhì)具有重要意義。

近年來，基于基因組學(xué)的測序技術(shù)使人們更加全面地了解環(huán)境樣本中微生物多樣性組成，轉(zhuǎn)錄組學(xué)（transcriptomics）、蛋白組學(xué)（protemics）、代謝組學(xué)（metabolomics）和流量組學(xué)（fluxomics）等技術(shù)的興起，可以更加系統(tǒng)更加深入地剖析環(huán)境樣本中微生物基因轉(zhuǎn)錄、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白表達以及代謝關(guān)系等[5-6]。其中，轉(zhuǎn)錄組廣義上是指在某一特定生理條件或者環(huán)境下，一個細胞、組織或者生物體中所有核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）總和，包括信使RNA（messenger RNA，mRNA）、核糖體RNA（ribosome，rRNA）、轉(zhuǎn)運RNA（transfer RNA，tRNA）以及非編碼RNA（non-coding RNA），狹義上是特指細胞中轉(zhuǎn)錄出來的所有mRNA的總和。

目前，對窖泥己酸的研究主要停留在對窖泥中的己酸菌進行分離鑒定，并利用傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法研究其產(chǎn)酸條件[7-9]，但是關(guān)于其代謝機理的研究報道較少，而且固態(tài)混合發(fā)酵比液體純種發(fā)酵方式更為復(fù)雜，液態(tài)發(fā)酵結(jié)果不一定能在窖泥發(fā)酵中再現(xiàn)。因此，本研究采用宏轉(zhuǎn)錄組技術(shù)主要研究產(chǎn)己酸關(guān)鍵酶基因在老化窖泥中的表達，并對老化窖泥中的己酸代謝途徑進行分析，研究結(jié)果有利于為提升白酒品質(zhì)奠定理論基礎(chǔ)，同時也為窖泥己酸的機理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 窖泥樣品

老化窖泥樣品：取自四川某酒廠，取樣人員佩戴無菌無酶手套、口罩，窖池打開后，迅速取樣，充分混合，放入液氮罐。樣品由液氮罐運回，-80 ℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 化學(xué)試劑

1.2 儀器與設(shè)備

1.3 方法

1.3.1 樣品總RNA的提取

1.3.2 老化窖泥宏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫構(gòu)建

老化窖泥樣品的宏轉(zhuǎn)錄組測序由上海派森諾生物公司完成。

提取窖泥樣品的總RNA后，去除rRNA，對mRNA進行富集并以mRNA為模板合成互補脫氧核糖核酸（cDNA）雙鏈。采用全轉(zhuǎn)錄鳥槍法（whole genome shotgun，WGS），基于Illumina HiSeq X-ten高通量測序平臺對構(gòu)建的文庫進行雙端測序。測序后，采用在線網(wǎng)站FastQC（http：//www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）對測序產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制，同時完成對高質(zhì)量序列的篩查和過濾。采用在線網(wǎng)站SortMeRNA（http：//bioinfo.lifl.fr/RNA/sortmerna/）[10]，將篩查后的有效序列集與軟件自帶的rRNA序列數(shù)據(jù)庫進行比對，剔除rRNA序列。對樣品的mRNA序列采用在線軟件Trinity（http：//trinityrnaseq.github.io/）[11]從頭組裝拼接，將拼接后的樣品與所有轉(zhuǎn)錄本進行比對，并把注釋到同一蛋白的轉(zhuǎn)錄本歸并為Unigene。將Unigene數(shù)據(jù)集與美國國立生物技術(shù)信息中心蛋白數(shù)據(jù)庫（National Center for Biotechnology Information Non-redundant protein collection，NCBI-NR）（ftp：//ftp.ncbi.nih.gov/blast/db/）、京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫（Kyoto ENcyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）（http：//www.genome.jp/kegg/）和碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫（Carbohydrate-Active enZymes Database，CAZy）（http：//www.cazy.org/）比對，分別獲得物種注釋、KEGG注釋、EggNOG注釋、CAZy注釋及各等級功能注釋表達量分布[12-15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 老化窖泥己酸代謝途徑及關(guān)鍵酶基因物種來源分析

圖1 老化窖泥中己酸合成途徑Fig.1 Biosynthesis pathway of caproic acid in aged pit mud

由圖1可知，在窖泥中己酸的生成途徑中，丙酮酸被丙酮酸氧化還原酶EC 1.2.7.1（0.033 2%）或2-氧酸氧化還原酶EC 1.2.7.11（0.025 4%）催化降解為乙酰輔酶A，在乙酰輔酶A-C-乙酰轉(zhuǎn)移酶EC 2.3.1.9（0.062 4%）的作用下催化生成乙酰乙酰輔酶A，再經(jīng)由乙酰乙酰輔酶A還原酶EC 1.1.1.36（0.005 3%）、3-羥?；o酶A脫氫酶EC 1.1.1.35（0.056 5%）、3-羥基丁酰輔酶A 脫氫酶EC 1.1.1.157（0.011 6%）催化生成3-羥基丁?；o酶A，經(jīng)由烯酰輔酶A水合酶EC 4.2.1.17（0.033 8%）或3-羥基丁酰輔酶A脫水酶EC 4.2.1.55（0.000 8%）生成巴豆酰輔酶A，再經(jīng)由反式-2-烯酰輔酶A還原酶EC 1.3.1.44（0.002 8%）催化生成丁酰基輔酶A。而乙酰輔酶A和丁酰基輔酶A被C-?；D(zhuǎn)移酶EC 2.3.1.16（0.032 3%）催化生成3-氧代己酰輔酶A，再經(jīng)3-羥?；o酶A脫氫酶EC 1.1.1.35、β-羥酰輔酶A脫氫酶EC 1.1.1.211（0.002 6%）、烯酰輔酶A水合酶EC 4.2.1.17、N-乙酰-γ-谷氨酰-磷酸還原酶EC 1.2.1.38（0.008 2%）的共同作用下催化生成己酰基輔酶A，從而進一步產(chǎn)生己酸。

丁酸是生產(chǎn)己酸的前體物質(zhì)，HU L等[16]驗證了克氏梭菌中一種產(chǎn)生丁酸的轉(zhuǎn)錄單元crt1-bcd-etfAB1-hbd1-nfnAB，而氧化還原敏感轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)器（redox-sensing transcriptional regulator，Rex）在碳循環(huán)和能量代謝中起重要作用，且可以調(diào)控丁酰輔酶A脫氫酶/電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白復(fù)合物（butyryl coenzyme A dehydrogenase/electronic transfer flavin protein complex，Bcd/EtfAB）和NADPH+氧化還原酶復(fù)合體（NADPH+oxidoreductase complex，NfnAB），從而直接或間接控制丁酸合成。將己酸循環(huán)關(guān)鍵酶基因3-羥基丁酰輔酶A脫水酶（dehydration of 3-hydroxybutyryl coenzyme A，crt1）、丁酰輔酶A脫氫酶（butyryl CoA dehydrogenase，bcd）、電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白A1（electronic transfer flavin protein complex A1，etfA1）、電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白B1（electronic transfer flavin protein complex B1，etfB1）、NADP依賴性3-羥基丁酰輔酶A脫氫酶（NADP-dependent 3-hydroxybutyrate coenzyme A dehydrogenase，hbd1）、NADPH+氧化還原酶A（NADPH+oxidoreductase A，nfnA）和NADPH+氧化還原酶B（NADPH+oxidoreductase B，nfnB）注釋到本批次窖泥樣品轉(zhuǎn)錄本中，發(fā)現(xiàn)基因hbd1與圖1中乙酰乙酰輔酶A還原酶EC 1.1.1.36、3-羥?；o酶A脫氫酶EC 1.1.1.35、3-羥基丁酰輔酶A脫氫酶EC 1.1.1.157在己酸生成中功能相似，基因crt1與圖1A中烯酰CoA水合酶EC 4.2.1.17和3-羥基丁酰CoA脫水酶EC 4.2.1.55功能相似，而基因bcd1、etfB1、etfA1、nfnA和nfnB則等同于圖1B中的乙酰-CoA C-?；D(zhuǎn)移酶EC 2.3.1.16?；诖?，挑選出己酸代謝系統(tǒng)中關(guān)鍵酶基因EC 1.1.1.36、EC 1.1.1.35、EC 1.1.1.157、EC 4.2.1.17、EC 4.2.1.55和EC2.3.1.16，并將其注釋到物種門水平來源，擬找出老化窖泥中的功能微生物與特征微生物。

圖2 老化窖泥中編碼己酸合成途徑關(guān)鍵酶基因在微生物門水平相對豐度Fig.2 Relative abundance of key enzyme gene involved in caproic acid biosynthesis at phylum level

由圖2可知，EC 1.1.1.36主要來源于變形菌門（Proteobacteria）（52.45%）和浮霉菌門（Planctomycetes）（1.96%）；EC 1.1.1.35主要來源于細菌中的變形菌門（Proteobacteria）（42.85%）、藍藻菌門（Cyanobacteria）（9.15%）、擬桿菌門（Bacteriodetes）（0.90%）和放線菌門（0.13%）以及真核生物界中的鏈型植物門（Streptophyta）（2.30%）、節(jié)肢動物門（Arthropoda）（0.96%）以及子囊菌門（Ascomycota）（0.32%）；EC 1.1.1.157主要來源于變形菌門（Proteobacteria）（20.67%）、厚壁菌門（Firmicutes）（11.76%）、擬桿菌門（Bacteriodetes）（3.02%）以及放線菌門（Actinobacteria）（2.54%）；EC 4.2.1.17主要來源于變形菌門（Proteobacteria）（50.10%）、放線菌門（Proteobacteria）（0.91%）、厚壁菌門（Firmicutes）（0.56%）以及真核生物界的鏈型植物門（Streptophyta）（7.47%）；EC 4.2.1.55主要來源于變形菌門（Proteobacteria）（42.85%）、藍藻菌門（Cyanobacteria）（9.15%）、擬桿菌門（Bacteriodetes）（0.90%）以及真核生物中的鏈型植物門（Streptophyta）（2.30%）、節(jié)肢動物門（Arthropoda）（0.96%）以及子囊菌門（Ascomycota）（0.32%）等；EC 2.3.1.16主要來源于變形菌門（Proteobacteria）（14.48%）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）（0.22%）以及脊索動物門（Chordata）（1.55%）。由此說明變形菌門在老化窖泥的己酸合成途徑中起重要作用，其次為厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、藍藻菌門，而真核生物在己酸合成途徑中具有一定貢獻，但關(guān)于其在窖泥中具體作用的研究較少。

將挑選出己酸代謝系統(tǒng)中關(guān)鍵酶基因EC 1.1.1.36、EC 1.1.1.35、EC 1.1.1.157、EC 4.2.1.17、EC 4.2.1.55和EC 2.3.1.16注釋到老化窖泥中物種種水平來源，結(jié)果見圖3。由圖3可知，EC 1.1.1.36主要來源于變形菌門中的食酸菌屬（Acidovoraxsp.）JS42（3.92%）和Gemmatasp.SH-PL17（1.96%）；EC 1.1.1.35主要來源于真核域的支鏈淀粉菌（Amyelois transitella）（4.31%）以及厚壁菌門中的普通變形桿菌（Proteus vulgaris）（9.34%）、脫鹵厭氧桿菌（Anaeromyxobacter dehalogenans）（1.12%）；EC 1.1.1.157主要來源于庫茲涅佐夫脫硫菌（Desulfotomaculum kuznetsovii）（11.76%）、脫鹵厭氧桿菌（Anaeromyxobacter dehalogenans）（8.11%）、玫瑰微囊藻（Minicystis rosea）（7.95%）、阿克蘇恩斯龐蒂巴桿菌（Pontibacter akesuensis）（1.59%）、黃桿菌科細菌（Flavobacteriaceae bacterium）MAR_2010_188（1.43%）、車前孢屬（Plantactinosporasp.）KBS50（1.27%）等；EC 4.2.1.17主要來源于脫鹵厭氧桿菌（Anaeromyxobacter dehalogenans）（7.58%）等；EC 4.2.1.55來源于自養(yǎng)黃桿菌（Xanthobacter autotrophicus）（11.11%）；EC 2.3.1.16主要來源于脫鹵厭氧桿菌（Anaeromyxobacter dehalogenans）（10.39%）等。

由圖3可知，未注釋到通常在窖泥中關(guān)注到的己酸菌[17-19]，而EC 1.1.1.35、EC 1.1.1.157、EC 4.2.1.17以及EC 2.3.1.16均可在脫鹵厭氧桿菌（Anaeromyxobacter dehalogenans）編碼得到，脫鹵厭氧桿菌（Anaeromyxobacter dehalogenans）是土壤中的一類重要的功能微生物，可在一定程度上避免大氣循環(huán)中的氮損失[20]，但是未見其與窖泥性狀關(guān)系的報道。因此，說明固態(tài)混合發(fā)酵不同于液態(tài)發(fā)酵，在純培養(yǎng)條件下己酸菌的代謝產(chǎn)物可由固態(tài)發(fā)酵中其他非己酸菌混合作用產(chǎn)生，上述菌株未被關(guān)注到的原因可能是在特定的篩選條件無法篩選未被認識的菌株，因此也進一步說明傳統(tǒng)的可培養(yǎng)方法并不能全面解析環(huán)境微生物的多樣性。雖然在以往的研究中，未見窖泥中關(guān)于脫鹵厭氧桿菌（Anaeromyxobacter dehalogenans）的報道，但是基于本研究中轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)注釋，推測脫鹵厭氧桿菌（Anaeromyxobacter dehalogenans）可能是窖泥中一類重要的功能微生物，還有待進一步研究。

圖3 老化窖泥中編碼己酸合成途徑關(guān)鍵酶基因在微生物種水平相對豐度Fig.3 Relative abundance of key enzyme gene involved in caproic acid biosynthesis at species level

除了上述與關(guān)鍵酶基因crt1、bcd、etfA1、etfB1、hbd1、nfnA和nfnB相似的基因外，根據(jù)圖1，還有可催化生成丁?；o酶A的反式-2-烯酰輔酶A還原酶EC 1.3.1.44（0.002 8%），催化生成3-羥基己?；o酶A的β-羥酰輔酶A脫氫酶EC1.1.1.211（0.002 6%）以及催化生成己酰輔酶A的N-乙酰-γ-谷氨酰-磷酸還原酶EC1.2.1.38（0.008 2%）。將其注釋到微生物物種，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，在微生物門水平上，EC1.3.1.44主要來源于螺旋體門（Spirochaetes）（9.09%）以及變形菌門（Proteobacteria）（6.36%）；EC1.1.1.211 主要來源于鏈型植物門（Streptophyta）（91.36%）；而EC 1.2.1.38 主要來源于脊索動物門（Chordata）（5.15%）。而在微生物屬水平，EC 1.3.1.44 主要來源于密螺旋體屬（Treponema）（9.09%）和歐文氏菌屬（Erwinia）（6.36%）；EC 1.1.1.211 主要來源于小麥屬（Triticum）（46.91%）、辣椒屬（Capsicum）（42.59%）和稻屬（Oryza）（1.85%）；EC 1.2.1.38 主要來源于鯡屬（Clupea）（5.15%）。

圖4 老化窖泥中編碼己酸合成途徑關(guān)鍵酶基因在微生物門（A）和屬（B）水平的相對豐度Fig.4 Relative abundance of key enzyme gene involved in caproic acid biosynthesis at phylum level (A) and genus level (B)

2.2 老化窖泥己酸相關(guān)代謝途徑分析

對乙酸代謝、丁酸代謝、乳酸代謝、丙酮酸代謝以及糖酵解途徑進行綜合分析，篩選出代謝通路中的關(guān)鍵酶基因，并對其注釋到物種來源，結(jié)果見圖5。由圖5可知，在丁酸代謝途徑中，丙酮酸通過丙酮酸氧化還原酶EC1.2.7.1（0.033 2%）和2-氧代酸氧化還原酶EC1.2.7.11（0.025 4%）轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A。丙酮酸降解生成乙酰輔酶A后，經(jīng)乙酰輔酶A-C-乙酰轉(zhuǎn)移酶EC2.3.1.9（0.062 4%）催化生成乙酰輔酶A（圖1），其后再參與到圖1中的代謝通路。同時，醋酸鹽和乙酰輔酶A之間則可以通過丙酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶EC2.8.3.1（0.001 8%）或乙酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶EC2.8.3.18（0.001 8%）實現(xiàn)其相互轉(zhuǎn)化。乙酰磷酸酯（acetyl phosphate，Acetyl-P）是醋酸鹽的底物之一，可以被乙酰磷酸酶EC3.6.1.7（0.005 7%）轉(zhuǎn)化為醋酸鹽，同時可以通過磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶EC2.3.1.8（0.003 7%）實現(xiàn)與乙酰輔酶A之間的相互轉(zhuǎn)化。而在醋酸鹽和乙醛之間，可以通過乙醛脫氫酶EC1.2.1.3（0.077 3%）、乙醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）EC1.2.1.5（0.001 1%）或者醛脫氫酶EC1.2.1.-（0.001 3%）實現(xiàn)相互轉(zhuǎn)化。

由圖5可知，D-乳酸和L-乳酸之間相互轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶乳酸消旋酶EC 5.1.2.1在老化窖泥中并未檢測到，而根據(jù)本實驗室前期的研究結(jié)果，在老熟窖泥的轉(zhuǎn)錄本中也未檢測到乳酸消旋酶[21]，推測不同性狀窖泥的某種共有理化特性導(dǎo)致了乳酸消旋酶mRNA 的降解、抑制了乳酸消旋酶的表達。L-乳醛是L-乳酸的前體物質(zhì)，將其轉(zhuǎn)化為L-乳酸的乳醛脫氫酶EC 1.2.1.22在老化窖泥中檢測到0.000 196%，但并未注釋到物種。丙酮酸與L-乳酸可通過L-乳酸脫氫酶EC 1.1.1.27（0.003 1%）相互轉(zhuǎn)化，同時，L-乳酸可以經(jīng)由另一種L-乳酸脫氫酶EC 1.1.2.3（0.001 2%）催化降解為丙酮酸。磷酸烯醇丙酮酸是丙酮酸的前體物質(zhì)，可以通過丙酮酸激酶EC 2.7.1.40（0.042 8%）實現(xiàn)轉(zhuǎn)化。由此可知，丙酮酸是窖泥中乙酸代謝、丁酸代謝、乳酸代謝以及己酸代謝重要的中間產(chǎn)物。

圖5 老化窖泥代謝圖Fig.5 Metabolic map of aged pit mud

3 結(jié)論

本研究采用宏轉(zhuǎn)錄組技術(shù)分析了老化窖泥中功能酶基因的表達情況以及己酸代謝途徑，通過測序及生物信息學(xué)分析，主要得出如下結(jié)論：

將產(chǎn)己酸關(guān)鍵基因crt1、bcd、etfA1、etfB1、hbd1、nfnA和nfnB注釋到轉(zhuǎn)錄本物種來源，發(fā)現(xiàn)真核生物在老化窖泥代謝中具有重要作用，幾組關(guān)鍵酶基因并未注釋到窖泥中關(guān)注較多的己酸菌，但是酶基因EC1.1.1.35、EC1.1.1.157、EC4.2.1.17以及EC2.3.1.16均可在脫鹵厭氧粘細菌（Anaeromyxobacter dehalogenans）找到，推測脫鹵厭氧粘細菌在窖泥中雖然含量不多，但可能是窖泥中一種活性微生物，具有重要功能，同時真核生物和變形菌門在老化窖泥的己酸代謝中，具有重要作用，窖泥中的己酸并非完全由己酸菌合成，而是其他非己酸菌共同作用的結(jié)果。

丙酮酸是連接乙酸代謝、丁酸代謝、乳酸代謝以及己酸代謝的重要中間產(chǎn)物。在老化窖泥中，丙酮酸通過丙酮酸氧化還原酶EC 1.2.7.1或者2-氧代酸氧化還原酶EC 1.2.7.11轉(zhuǎn)化為乙酰CoA，但是不能通過丙酮酸甲酸裂解酶EC 2.3.1.54轉(zhuǎn)化丙酮酸，同時老熟和老化窖泥中某些共有特性使乳酸消旋酶EC 5.1.2.1無法表達從而導(dǎo)致D-乳酸和L-乳酸之間在老熟和老化窖泥中不能通過乳酸消旋酶EC 5.1.2.1直接相互轉(zhuǎn)化。

本研究利用宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法探測了窖泥中活性微生物的動態(tài)表達，不僅有利于尋找窖泥微生物的差異表達基因，還可以幫助探明濃香型白酒關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)的代謝通路，為濃香型白酒生產(chǎn)企業(yè)及時養(yǎng)窖護窖、提高白酒品質(zhì)提供了理論依據(jù)。