王奕芳，溫承坤，陳茂彬，張 玉，李 琴，方尚玲*

（1.湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院，湖北 武漢 430068；2.湖北省釀造工藝與裝備工程技術(shù)中心，湖北 武漢 430068）

麻城老米酒已有一千年釀造歷史，主要產(chǎn)于麻城市東部地區(qū)的木子店、東古城等地。其由糯米和特制酒曲制成，色澤清亮，味道淳甜，含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和功能成分[1]。因而深受人民群眾歡迎。麻城老米酒屬于黃酒的一種，與黃酒相同的也含有酚類物質(zhì)。

多酚又稱單寧，是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的多元酚化合物。多酚的獨(dú)特結(jié)構(gòu)使其具有一些獨(dú)特的功能性[2-3]，如清除自由基和抗衰老，多酚物質(zhì)對保護(hù)心腦血管系統(tǒng)和預(yù)防心臟病也非常重要，它還是一種天然的腫瘤抑制劑因子，對肝癌、皮膚癌、鼻咽癌等有較強(qiáng)的抑制作用[4-5]。建立準(zhǔn)確的定量方法對研究麻城老米酒的保健功能具有重要意義。國內(nèi)外多酚的檢測方法主要包括紫外分光光度法、熒光檢測、毛細(xì)管電泳-電化學(xué)方法、高效液相色譜法，其中單體酚類的檢測最常用方法是高效液相色譜（high performance liquid chormatography，HPLC）法，該方法準(zhǔn)確、靈敏[6-8]。如姜莉等[9-10]對黑米酒、陳磊等[11]對黃酒、譚悅等[12]對木瓜酒多種酚類物質(zhì)進(jìn)行測定，建立了可靠的分析方法。

本實(shí)驗(yàn)以糯米為原料，經(jīng)半固態(tài)發(fā)酵釀造獲得富含多種活性成分的麻城老米酒，采用高效液相色譜法著重分析麻城老米酒中的多酚含量，旨在了解麻城老米酒中功能性成分的含量，為麻城老米酒工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麻城老米酒：麻城市某酒廠生產(chǎn)的三種不同類型的酒，分別為c1（在米曲中添加酵母K）、c2（在米曲中添加酵母cxds）、c3（在米曲中添加酵母S）。

11種酚類標(biāo)準(zhǔn)品（香草酸、沒食子酸、原兒茶酸、對香豆酸、兒茶素、表兒茶素、槲皮素、蘆丁、阿魏酸、綠原酸、咖啡酸）：上海源葉生物科技有限公司；甲醇、甲酸、乙醇（均為色譜純）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；乙酸乙酯、甲酸、氫氧化鈉（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Ultimate 3000高效液相色譜儀及檢測器、Hypersil Gold C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）：美國Thermo Scientific公司；Ev201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：北京萊伯泰科儀器股份有限公司；DTD-3R超聲波清洗儀：湖北鼎泰精銳儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 麻城老米酒釀造工藝及操作要點(diǎn)

糯米→選料→浸泡→濾水→水洗→蒸飯→攤涼→拌曲、加水→裝缸→發(fā)酵→壓榨→澄清→滅菌→成品

選料：選取顆粒飽滿，無雜質(zhì)，無霉變的糯米。

浸泡：秋季浸米的時長8～10 h，浸米水溫20～25 ℃；冬季浸米的時長12～15 h，浸米水溫10～15 ℃。

濾水、水洗：把浸米的水濾掉之后，再用清水清洗2～3遍即可。

蒸飯：蒸米以蒸汽冒出時開始計(jì)時，出蒸汽15～20 min，蒸米要求米粒松、軟、透、不粘連。

攤涼：是在潔凈衛(wèi)生竹制涼席上自然降溫，冷卻至20～30 ℃。

拌曲：先在缸內(nèi)撒一層曲，然后一層米一層曲，直到把原料放完（一缸是50 kg米），最后倒入水，再撒入剩余的曲，封缸發(fā)酵（發(fā)酵中途不能開缸）。

發(fā)酵：在20 ℃左右的情況下，發(fā)酵一個月。

壓榨、澄清：經(jīng)30 d發(fā)酵，酒液開始澄清，說明發(fā)酵基本結(jié)束，此時可以開壇取酒，把酒裝入壓榨機(jī)進(jìn)行壓榨，讓酒糟分離。壓榨出來的酒通過沉淀后，裝入酒瓶中。

滅菌：75 ℃滅菌15～20 min。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品兒茶素、表兒茶素、蘆丁、槲皮素、原兒茶酸、p-香豆酸、阿魏酸、香草酸、綠原酸、咖啡酸以及沒食子酸于25 mL容量瓶中，甲醇定容，分別配制成兒茶素13 μg/mL、表兒茶素13.75 μg/mL、蘆丁15.75 μg/mL、槲皮素16.75 μg/mL的中性酚標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，咖啡酸14 μg/mL、原兒茶酸19.5μg/mL、綠原酸16.25μg/mL、阿魏酸14.75 μg/mL、沒食子酸13.75 μg/mL、對香豆酸14.25 μg/mL的酸性酚標(biāo)準(zhǔn)品儲備液和香草酸16.6 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，儲存于4 ℃冰箱中備用。將以上的各標(biāo)準(zhǔn)品儲備液用甲醇稀釋5倍、10倍、25倍、62.5倍、100倍，并分別進(jìn)樣分析作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 樣品前處理方法

參照文獻(xiàn)[13-14]，取50 mL的樣品，先用鹽酸溶液調(diào)至pH2.0，再用150 mL乙酸乙酯分3次萃取，合并萃取液并真空濃縮至干，然后用甲醇定容至5 mL，得到麻城老米酒的酸性酚。將萃取余液用NaOH溶液調(diào)至pH7.0，然后用乙酸乙酯萃取，合并萃取液并真空濃縮至干，得到麻城老米酒中性酚樣品。

1.3.4 色譜條件

色譜柱為Hypersil GOLD（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相A為0.1%甲酸，流動相B是甲醇，并使用梯度洗脫，梯度洗脫程序見表1。流速1 mL/min，紫外檢測波長280 nm，進(jìn)樣量20 μL。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure

2 結(jié)果與分析

2.1 流動相的選擇

圖1 中性酚混合標(biāo)樣色譜圖Fig.1 Chromatogram of neutral phenol mixed standard

圖2 稀釋過的中性酚混合標(biāo)樣色譜圖Fig.2 Chromatogram of diluted neutral phenol mixed standard

由圖1和圖2可知，以C18柱用作固定相時，常用的流動相有甲醇-水、乙腈-水等。但是本實(shí)驗(yàn)主要檢測的是酚類物質(zhì)，酚類物質(zhì)由于含有酚羥基、羧基，這些基團(tuán)在水溶液中易發(fā)生電離，易出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。添加少量酸性試劑，可以抑制酚類物質(zhì)的電離，提高分離度，避免色譜峰的拖尾[15-17]。分別嘗試0.1%乙酸和甲醇、0.1%甲酸和甲醇、0.1%乙酸和乙腈、0.1%甲酸和乙腈，實(shí)驗(yàn)最終選擇0.1%甲酸為流動相A，甲醇為流動相B，在此條件下，梯度洗脫時，基線發(fā)生較小的飄移，并且獲得更好的分離[18-20]。為了使峰型更好，用流動相1∶1稀釋樣品，結(jié)果表明，稀釋過后得出的峰分離效果更佳。

2.2 色譜條件的確定

從上述實(shí)驗(yàn)中，最終確定分離多酚類物質(zhì)的色譜條件是檢測波長280 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量為20 μL，0.1%甲酸水溶液與甲醇梯度洗脫。在該色譜條件下進(jìn)樣，得到標(biāo)樣中酸性酚及香草酸的分離色譜圖和保留時間（retention time，RT）分別見圖3、圖4。

圖3 酸性酚混合標(biāo)樣色譜圖Fig.3 Chromatogram of acid phenol mixed standard

圖4 香草酸標(biāo)樣色譜圖Fig.4 Chromatogram of vanillic acid standard

由圖3～圖4可知，11種酚類物質(zhì)得到了很好地分離。與姜莉等[5]對黑米酒、譚悅等[11]對木瓜酒、謝廣發(fā)[14]對黃酒多種酚類物質(zhì)進(jìn)行測定相比，分離時間較短，在22 min之內(nèi)，11種物質(zhì)就能得到分離，且洗脫程序不復(fù)雜，分離效果良好。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限

采用以上確定的色譜條件，得到以下11種酚類物質(zhì)的回歸方程見表2。由表2可知，線性關(guān)系良好，且相關(guān)系數(shù)R均＞0.999 0。各組分目標(biāo)物的檢出限為0.117～0.156 mg/L，滿足不同種類物質(zhì)的檢測要求。

表2 11種酚類物質(zhì)回歸方程及檢出限Table 2 Regression equations and detection limits of 11 phenolic compounds

2.4 老米酒中酚類物質(zhì)分析

按照1.3.4方法對老米酒樣品c1、c2、c3處理，對處理過的樣品進(jìn)行高效液相色譜分析，樣品中酚類物質(zhì)含量見表3。

表3 樣品中酚類物質(zhì)含量的測定結(jié)果Table 3 Determination results of phenolic content in samples mg/L

由表3可知，3種不同類型的老米酒中含有豐富的酚類，其中c1老米酒中含量最高的是香草酸，其次是兒茶素、表兒茶素以及蘆丁；c2老米酒中含量最高的是表兒茶素，其次是蘆丁、兒茶素以及阿魏酸；c3老米酒中含量最高的是兒茶素，其次是原兒茶酸、表兒茶素以及香草酸。從測定的這11種單酚來看，兒茶素、表兒茶素、蘆丁是這3種老米酒中主要的單酚物質(zhì)，占總含量的比例較大?；厥章蕼y定結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為0.48%～2.75%，而3種不同類型老米酒11種酚類總量與紹興黃酒比起來，含量相對較低，與紅米酒比起來，含量稍高一些。這可能由于酒中的酚類物質(zhì)主要來源于原料（大米、小麥）和微生物（米曲霉、酵母）的轉(zhuǎn)化，特別是由于發(fā)酵周期長（傳統(tǒng)工藝酒達(dá)100 d左右），小麥帶皮發(fā)酵，麥皮中的大量酚類物質(zhì)融入酒中[20-22]。老米酒發(fā)酵時長比起紹興黃酒較短，而比起米酒時長較長，且紹興黃酒一般用的酒曲是麥曲，而老米酒用的甜酒曲，這些原因都會導(dǎo)致酚類物質(zhì)的含量不同。

3 結(jié)論

在選定的色譜條件下，首次采用高效液相色譜測定麻城老米酒中的11種酚類物質(zhì)，并且在22 min之內(nèi)使這11種物質(zhì)得到了較好的分離，11種酚類物質(zhì)的回收率在86.2%～102.3%，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.48%～2.75%，說明此測定方法準(zhǔn)確可靠。

由以上實(shí)驗(yàn)可知，麻城老米酒中含有一定量的酚類物質(zhì)。3種不同類型的老米酒中含有豐富的酚類，其中c1老米酒中含量最高的是香草酸，其次是表兒茶素、兒茶素以及蘆丁，c2老米酒中含量最高的是表兒茶素，其次是兒茶素、蘆丁以及阿魏酸，c3老米酒中含量最高的是兒茶素，其次是表兒茶素、原兒茶素以及蘆丁。從測定的這11種單酚來看，兒茶素、表兒茶素、蘆丁是這3種老米酒中主要的單酚物質(zhì)，占總含量的比例較大。并使其測定結(jié)果與紹興黃酒、紅米酒中酚類物質(zhì)含量的對比發(fā)現(xiàn)，麻城老米酒中酚類物質(zhì)的含量與其工藝密切相關(guān)，為老米酒類產(chǎn)品的開發(fā)和保健功能的研究提供依據(jù)。

本次實(shí)驗(yàn)只對麻城老米酒中的酚類進(jìn)行了檢測，而麻城老米酒中不僅僅含有酚類，還含有其他的功能成分，比如氨基酸、維生素等，有待進(jìn)一步的研究。