黃海洪，朱艷蘭，類延菊，陳靈靈，楊品紅

(湖南文理學(xué)院 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院, 湖南 常德 415000)

0 引 言

氮元素的累積是水體富營養(yǎng)化的重要原因[1]。尤其是在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，由于使用大量的人工配合飼料，而利用率卻比較低，大部分(約75%，以飼料蛋白氮計(jì)算)都流失到了水體[2]，最終轉(zhuǎn)化為無機(jī)氮，極易被藻類吸收利用，引起過度繁殖。亞硝酸氮是該過程的重要中間產(chǎn)物[3]，具有較強(qiáng)的生物毒性[4]，因而是水環(huán)境保護(hù)和水產(chǎn)養(yǎng)殖等領(lǐng)域一項(xiàng)重要的監(jiān)測(cè)指標(biāo)[5-6]。

目前，水體亞硝酸氮的測(cè)定以及教學(xué)實(shí)驗(yàn)一般采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法[7-8]，但是試劑配制比較復(fù)雜，操作也較為繁瑣。針對(duì)亞硝酸氮的測(cè)定也開發(fā)了商品化的檢測(cè)試劑盒[9-11]，試劑用量少，容易保存，操作安全、簡單，且價(jià)格低廉，在生產(chǎn)實(shí)踐中得到了廣泛應(yīng)用，但是一般只用于定性或半定量的分析，定量測(cè)定方面受到的關(guān)注較少。本文根據(jù)亞硝酸氮常用的分光光度法[9]的測(cè)定原理，對(duì)商品化試劑盒測(cè)定亞硝酸氮的方法進(jìn)行改良，以期為水體亞硝酸氮的快速測(cè)定以及教學(xué)實(shí)驗(yàn)的開展提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.2 亞硝酸氮標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

亞硝酸氮標(biāo)準(zhǔn)溶液參照文獻(xiàn)[8]中所述方法配制，稍作修改。亞硝酸鈉在100～105 ℃下干燥2 h，稱重，溶于蒸餾水中，容量瓶定容、稀釋，配制不同亞硝酸氮濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液。

1.3 樣品處理

樣品的處理參照試劑盒操作說明(www.apifishcare.com)進(jìn)行，稍作修改。取1 mL樣品溶液，加入顯色劑，混勻，制備顯色反應(yīng)液。靜置5 min，待顏色形成并穩(wěn)定，加入2 mL蒸餾水，混勻，備用以測(cè)定吸光度。以蒸餾水為空白對(duì)照，按上述步驟制備空白顯色反應(yīng)液。

1.4 測(cè)定條件優(yōu)化

(1)吸收波長的確定。在380～700 nm波長范圍內(nèi)，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液和空白對(duì)照的顯色反應(yīng)液吸光度進(jìn)行掃描，以空白顯色反應(yīng)液作為對(duì)照，選取使樣品顯色反應(yīng)液吸光度大,而空白顯色反應(yīng)液吸光度小的波長，作為測(cè)定波長。

(2)顯色劑用量的選擇。分別用40～360 μL顯色劑處理標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液，制備顯色劑用量不同的反應(yīng)液，測(cè)定吸光度，選取使反應(yīng)液吸光度大且處于穩(wěn)定狀態(tài)的體積，作為顯色劑的用量。

1.5 吸光度測(cè)定以及回歸方程擬合

不同濃度的亞硝酸氮標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液各取1 mL，按照試劑盒處理方法制備顯色反應(yīng)液，在優(yōu)化的顯色劑用量、吸收波長等參數(shù)條件下，測(cè)定吸光度。然后以吸光度為橫坐標(biāo)、亞硝酸氮濃度為縱坐標(biāo)，應(yīng)用CurveExpert 2.0軟件(www.curveexpert.net)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合回歸方程。

1.6 回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算

標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液用試劑盒處理，測(cè)定吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算樣品亞硝酸氮濃度的理論值，與真實(shí)濃度進(jìn)行比較，按下式計(jì)算樣品的回收率[7]：

(1)

式中：R為回收率；ρt為標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液真實(shí)亞硝酸氮濃度;ρd為根據(jù)回歸方程理論計(jì)算的亞硝酸氮濃度，mg/L。

測(cè)量值相對(duì)真實(shí)值的標(biāo)準(zhǔn)偏差(相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差)參照文獻(xiàn)[7]所述方法計(jì)算，但是本研究的測(cè)量值是未設(shè)置重復(fù)的數(shù)據(jù)，因此根據(jù)文獻(xiàn)[12]稍作修改,計(jì)算公式如下：

(2)

式中:n為標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的數(shù)量，n≥2；i= 1，2，…，n；ρti和ρdi分別表示第i個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液亞硝酸氮的真實(shí)濃度和測(cè)量濃度，mg/L。

1.7 含氮物質(zhì)對(duì)亞硝酸氮測(cè)定的影響

參照亞硝酸氮標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的配制方法，分別制備硝酸鈉、氯化銨和大豆蛋白胨標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后用亞硝酸氮檢測(cè)試劑盒進(jìn)行處理，制備顯色反應(yīng)液，測(cè)定吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算亞硝酸氮濃度，作為由其他含氮物質(zhì)對(duì)亞硝酸氮測(cè)定造成的誤差濃度，以此研究硝酸氮、氨氮和有機(jī)氮等對(duì)亞硝酸氮測(cè)定的影響。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用卡方檢驗(yàn)方法檢查測(cè)量值與真實(shí)值的差異顯著性[12]，通過調(diào)用Excel CHISQ.TEST程序?qū)崿F(xiàn)，P< 0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 測(cè)定條件

分別測(cè)定了1.08 mg/L亞硝酸氮標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液和空白對(duì)照顯色反應(yīng)液在380～700 nm波長范圍內(nèi)的吸光度(圖1(a))。結(jié)果顯示，亞硝酸氮樣品的顯色反應(yīng)液在620 nm 處具有最大吸收峰，在540 nm處也有一個(gè)較小的吸收峰。但是空白顯色反應(yīng)液在620 nm處也具有單一最大吸光度，且在380～440 nm和600～700 nm范圍內(nèi)，與樣品溶液顯色反應(yīng)液的吸光度相差不大。從460 nm開始，樣品溶液與空白對(duì)照顯色反應(yīng)液的吸光度差別逐漸增大，在540 nm處達(dá)到最大，說明此時(shí)顯色劑對(duì)樣品溶液的干擾最小。

圖1 波長(a)與顯色劑用量(b)對(duì)樣品反應(yīng)液吸光度的影響

不同顯色劑用量條件下0.76和2.15 mg/L兩種亞硝酸氮樣品的吸光度變化見圖1 (b)。結(jié)果顯示，兩種樣品溶液均在顯色劑用量為200 μL的條件下，達(dá)到較高的吸光度，并趨于穩(wěn)定。

檢測(cè)試劑盒與分光光度計(jì)都是依據(jù)比色的原理進(jìn)行工作，為兩種方法的結(jié)合應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。但是試劑盒依據(jù)肉眼判斷進(jìn)行比色，不夠精確。因此，使用試劑盒進(jìn)行定量測(cè)定，需要輔以分光光度計(jì)進(jìn)行精確的吸光度測(cè)定。首先要確定最佳的吸收波長，使顯色反應(yīng)液的吸光度最大，提高檢測(cè)靈敏度，同時(shí)使顯色劑的干擾最小，檢測(cè)準(zhǔn)確度最優(yōu),其次要確定顯色劑的用量，使樣品充分顯色，但是也要控制用量以減小顯色劑的干擾[13-15]。根據(jù)上述原則，確定540 nm為測(cè)定亞硝酸氮濃度的最佳吸收波長，這與重氮-偶氮光度法的吸收波長(543 nm)大致相同[8]。從樣品充分顯色和減小干擾的角度綜合考慮，采用200 μL作為最適的顯色劑用量，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他常用方法的用量[7, 8]。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與回歸方程

按照試劑盒處理樣品的方法，在顯色劑用量為200 μL，波長為540 nm條件下，分別測(cè)定了8.60、4.30、2.15、1.08、0.54、0.27、0.13和0.07 mg/L標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液顯色反應(yīng)液的吸光度，然后以吸光度為自變量、亞硝酸氮濃度為因變量，繪制了標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖2)，擬合的回歸方程為：

ρ=0.033 7+4.283 5a

r=0.999 8,P<0.01

(3)

式中:ρ為亞硝酸氮濃度;a為吸光度;r相關(guān)系數(shù)?；貧w方程極顯著(P<0.01)，濃度與吸光度的相關(guān)系數(shù)0.999 8，表明亞硝酸氮濃度與吸光度具有非常好的線性關(guān)系，應(yīng)用檢測(cè)試劑盒定量測(cè)定硝酸氮含量的方法是可行的。但是，回歸方程的常數(shù)項(xiàng)大于0(0.033 7)，說明該方法具有測(cè)量下限。本研究使用的分光光度計(jì)能夠讀出的最小吸光度為0.001，此時(shí)根據(jù)回歸方程計(jì)算可得硝酸氮濃度為0.04 mg/L，可作為本方法的測(cè)量下限。Lambert-Beer定律表明吸光度不超過1.0時(shí)，濃度與吸光度具有較好的線性關(guān)系[14]。因此，假定吸光度為1.0，通過回歸方程計(jì)算得到硝酸氮濃度為4.32 mg/L，可作為本方法的測(cè)量上限。

N-(1-萘基)-乙二胺光度法的測(cè)量范圍為0.003～0.20 mg/L[7]，邊超等[11]研制的水體亞硝酸氮的現(xiàn)場(chǎng)快速測(cè)定方法測(cè)量范圍為0.01～0.20 mg/L，而本文所述方法測(cè)量范圍為0.04～4.32 mg/L，可能是由于采用的測(cè)定試劑不一致造成的。根據(jù)說明書，該試劑盒能夠識(shí)別的硝酸氮最大濃度為5.00 mg/L(www.apifishcare.com)，與本法的測(cè)量上限(4.32 mg/L)接近。

圖2 吸光度與亞硝酸氮濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 回收率與測(cè)定偏差

測(cè)定了濃度分別為0.64、0.96、1.90、3.80、7.60和15.20 mg/L樣品溶液的吸光度，根據(jù)回歸方程得到理論濃度，并計(jì)算了回收率。由表1可知，濃度為0.64～3.80 mg/L的樣品在本研究方法測(cè)定下限和上限范圍(0.04～4.32 mg/L)之內(nèi)，亞硝酸氮的回收率為99.00%～105.61%，相對(duì)偏差為 ± 4.54%，符合亞硝酸氮監(jiān)測(cè)的實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制指標(biāo)范圍(亞硝酸氮濃度 > 0.2 mg/L，回收率95%～105%，偏差 ≤± 5%)[7]，卡方檢驗(yàn)結(jié)果也顯示測(cè)量值與真實(shí)值差異不顯著(P= 0.999 5)。當(dāng)濃度高于測(cè)定上限(> 4.32 mg/L)，雖然濃度為7.60 mg/L樣品的回收率也達(dá)到99.30%，但15.20 mg/L樣品的回收率卻只有63.01%，卡方檢驗(yàn)顯示測(cè)量值與真實(shí)值差異也不顯著(P= 0.069 4)，但相對(duì)偏差比較大，達(dá)到 ± 34.20%(見表1)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制指標(biāo)范圍[7]。上述結(jié)果表明，在測(cè)量范圍之內(nèi)(0.04～4.32 mg/L)本法具有較高的準(zhǔn)確度和可信度。

表1 亞硝酸氮測(cè)定回收率

2.4 其他含氮物質(zhì)對(duì)測(cè)定的影響

表2列舉了硝酸鈉、氯化銨和蛋白胨(有機(jī)氮)標(biāo)準(zhǔn)溶液用API?亞硝酸氮檢測(cè)試劑盒處理后，反應(yīng)液吸光度的變化。結(jié)果顯示，濃度為0.92～92.19 mg/L范圍的氯化銨引起的亞硝酸氮誤差濃度為0.02～0.09 mg/L，平均0.05 mg/L，稍高于亞硝酸氮的測(cè)量下限(0.04 mg/L)，卡方檢驗(yàn)顯示誤差濃度與溶液中真實(shí)的亞硝酸氮濃度差異不顯著(P= 0.973)。與此類似，3.03～303.44 mg/L的硝酸鈉引起的亞硝酸氮濃度誤差為0.05～0.06 mg/L，平均0.058 mg/L，與真實(shí)濃度差異不顯著(P= 0.978)。有機(jī)氮對(duì)亞硝酸氮測(cè)定的干擾差異也不顯著(P= 0.783)，10～1 000mg/L(以總氮計(jì))引起的誤差濃度僅為0.04～0.37mg/L。應(yīng)用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法測(cè)定亞硝酸氮時(shí)，只有氯胺、氯、硫代硫酸鹽、聚磷酸鈉和高鐵離子等物質(zhì)的干擾較大，而氨氮、硝酸氮和有機(jī)氮等的干擾較小[7]。陳靜儀等[9]也認(rèn)為氨氮、硝酸氮等對(duì)亞硝酸氮測(cè)定的干擾較小，與本研究的結(jié)果一致。

表2 含氮物質(zhì)對(duì)亞硝酸氮測(cè)定的影響

注：*，以大豆蛋白胨作為有機(jī)氮，濃度用總含氮量表示

3 結(jié) 語

結(jié)合分光光度法建立了應(yīng)用試劑盒定量測(cè)定水體亞硝酸氮的方法，試劑用量少(200 μL)，操作簡便，測(cè)定結(jié)果與真實(shí)濃度無顯著性差異(P> 0.05)，具有較高的可信度，回收率在99%以上，回歸方程相關(guān)系數(shù)0.999 8，測(cè)定范圍0.04～4.32 mg/L，硝酸氮、氨氮和有機(jī)氮對(duì)測(cè)定的干擾也均不顯著(P> 0.05)，為水體亞硝酸氮的快速定量測(cè)定以及教學(xué)實(shí)驗(yàn)提供了一種新的手段。