高越穎，劉 蕾，惠人杰

(江南大學 藥學院，江蘇 無錫 214122 )

0 引 言

制藥工程專業(yè)是培養(yǎng)具有新藥研究與開發(fā)的基本能力，能夠解決制藥工程實際問題能力的人才，注重的問題是如何評價所產(chǎn)生藥品的藥學質(zhì)量。藥理學實驗教學正是培養(yǎng)這種能力的主要學科之一。近年來，我院藥理學實驗教學不斷更新實驗教學項目，增加開放設(shè)計創(chuàng)新實驗，以培養(yǎng)學生藥物評價能力、科研創(chuàng)新能力及解決制藥工程實際問題的能力[1-3]。

藥物代謝動力學研究是藥理學實驗的重要內(nèi)容，對藥物研究開發(fā)、臨床合理用藥和藥品質(zhì)量控制具有重大的理論和實用價值[4-5]，但傳統(tǒng)教材中的研究對象(如溴磺酞鈉/水楊酸鈉)及血藥濃度分析方法(紫外分光光度法)較為陳舊，不利于激發(fā)學生學習興趣及科研創(chuàng)新能力的培養(yǎng)。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)為現(xiàn)代分析技術(shù)中的成熟技術(shù)，廣泛應(yīng)用于科研及制藥行業(yè)[6-9]，一般本科實驗教學中對該類技術(shù)的介紹較少。為此，課程結(jié)合學院科研成果，引入現(xiàn)代分析技術(shù)，設(shè)計了題為“化合物X在小鼠體內(nèi)藥物代謝動力學研究”實驗。以學院自主研發(fā)的一種新型抗血吸蟲化合物——吡喹酮類似物為研究對象，采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)作為血藥濃度分析方法，研究了該化合物在小鼠體內(nèi)的藥物代謝動力學特征。通過該實驗，學生不僅能鞏固藥理學基礎(chǔ)理論知識和動物實驗基本實驗操作技能，也能深入、全面、系統(tǒng)地掌握一般化學藥物的藥物代謝動力學實驗的設(shè)計原則與研究方法，了解和掌握前沿分析測試技術(shù)，切實提高了學生綜合運用知識的能力。

1 實驗材料和儀器

1.1 儀 器

Quattro LC MicroMass三重四級桿質(zhì)譜儀，2695型液相色譜儀，美國Waters公司；vortex3000渦旋震蕩混勻儀，德國WIGGENS公司；TGL-16G離心機，上海安亭科學儀器廠。

1.2 材料與試劑

吡喹酮類似物為本實驗自制；吡喹酮(PZQ)對照品(濰坊三江醫(yī)藥化工公司)；甲醇、乙腈(色譜純，TEDIA)；超純水。

1.3 實驗對象

ICR小鼠，雄，SPF級，體質(zhì)量(18～22 g)，由揚州大學實驗動物中心提供。

2 實驗方法

2.1 色譜條件及質(zhì)譜條件

(1)色譜條件。色譜柱：Luna 3u C18(2)柱 (2×100 mm，3 micron)；流動相：乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)；流速：0.3 mL/min；柱溫：35 ℃。流動相梯度洗脫比例見表1。

表1 HPLC-MS/MS流動相梯度洗脫條件

(2)質(zhì)譜條件。離子源：電噴霧離子化源(ESI)；正離子模式；毛細管電壓3.32 kV；錐孔氣流量45 L/h；脫溶劑氣溫度：350 ℃；離子源溫度：100 ℃；脫溶劑氣流量550 L/h。質(zhì)譜檢測器選擇性監(jiān)測條件見表2。

表2 HPLC-MS/MS質(zhì)譜檢測器監(jiān)測參數(shù)

2.2 溶液制備

(1)對照品溶液。精密稱取吡喹酮類似物50 mg，置于50 mL容量瓶中，加入100%甲醇溶解并定容，得到1 g/L母液，精密吸取母液用乙腈稀釋成 7.0，5.0，3.0，1.0，0.10 mg/L的系列樣品。

(2)內(nèi)標溶液。精密稱取內(nèi)標5.0 mg置于25 mL容量瓶中，加入100%乙腈溶解并定容，得到0.2 μg/mL 的內(nèi)標母液。

2.3 血漿樣品處理

取血漿樣品100 μL，置2 mL離心管中，加入吡喹酮內(nèi)標溶液10 μL(0.2μg/mL)，乙腈240 μL，渦旋60s，離心8 min(12 000 r/min)，取上清經(jīng)自動進樣器進樣10 μL，進行HPLC-MS/MS分析。

2.4 標準曲線的制備

取7.0，5.0，3.0，1.0，0.10 mg/L乙腈溶解的吡喹酮類似物 10 μL，加入到90 μL小鼠空白血漿中，按“2.2”項下方法進行處理測定。以吡喹酮類似物的峰面積A1/內(nèi)標峰面積A2為縱坐標，濃度C (μg/L)為橫坐標，繪制標準曲線。

2.5 藥物代謝動力學試驗

雄性昆明種小鼠24只，隨機分成3組，實驗前禁食12 h，自由飲水，按20 mg/kg灌胃吡喹酮類似物溶液。于給藥后0.5、1、2、2.5、3、4、5、6 h，每個時間點分別從各組取1只小鼠，摘眼球取血，置于1.5 mL離心管中(肝素預處理抗凝)，離心(3 500 r/min,5 min)，取血漿，按“2.4”項下方法進行處理測定，計算血漿吡喹酮類似物濃度。將各時間點數(shù)據(jù)用DAS2.0軟件計算藥物代謝動力學參數(shù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 標準曲線

按“2.4”項下方法分析結(jié)果，計算出相應(yīng)的回歸方程：A1/A2=0.046 9C+2.324 8，R2=0.998 2，結(jié)果表明吡喹酮類似物在10～700 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，見圖1。

圖1 吡喹酮類似物的標準曲線

3.2 藥物代謝動力學參數(shù)

小鼠灌胃吡喹酮類似物溶液后，各時間點測得的平均血藥濃度見圖2。用DAS2.0軟件擬合，其藥物代謝動力學特征用統(tǒng)計矩參數(shù)表示，結(jié)果見表3。研究結(jié)果顯示，吡喹酮類似物單次給藥在1.667 h左右達到最大濃度，其最大濃度為61.067 μg/L，血漿消除半衰期T1/2為9.569 h。

圖2 血漿中吡喹酮類似物的濃度-時間曲線(n=3)

表3 吡喹酮類似物的主要藥物代謝動力學參數(shù)

4 討 論

4.1 課程設(shè)計

本設(shè)計性實驗由學生根據(jù)已有資料及實驗室條件自行設(shè)計，老師組織學生對實驗方案進行論證，選取最優(yōu)方案進行實施，實驗實施過程中教師進行適當指導。

臨床前藥物代謝動力學主要研究內(nèi)容包括：血藥濃度-時間曲線、吸收、分布、排泄、與血漿蛋白的結(jié)合、生物轉(zhuǎn)化、對藥物代謝酶活性的影響等內(nèi)容。本文選擇“血藥濃度-時間曲線”進行研究，實驗過程大致如下：將目標化合物通過適當方式給予受試動物，然后按照一定的時間間隔采集血樣，采用合適的分析方法測定血樣中的藥物濃度，由此得到一系列的血藥濃度對時間變化的數(shù)據(jù)，從而求出藥代動力學參數(shù)。全班分3大組，每組負責完成一條藥-時曲線的樣本采集，即每個時間點從一只小鼠取血、取材，則全班每個時間點的重復數(shù)為3(n=3)，給藥、取血、血漿樣品處理及血藥濃度測定等步驟分別由同一位學生完成，以保證給藥、取血時間的一致性，以及檢測結(jié)果的準確性，減少由不同學生取血造成的組內(nèi)誤差，由表3可見存在一定的組間誤差，有可能由于不同組間取血人員的不同造成。但實驗過程中小組成員既有分工又有合作，每位學生均能參與操作并能了解到完整的實驗過程，對學生的團隊協(xié)助精神很有幫助。

樣品測定前由帶教老師先調(diào)試好儀器，由同一位學生完成標準品溶液的配置及檢測，并用同一臺儀器進行檢測；各組學生只需進行血漿樣本的處理，并通過0.45 μm濾器過濾到進樣瓶中，放到自動進樣器中，等待自動進樣分析。

4.2 實驗內(nèi)容的拓展

考慮到實驗課時的限制，在完成教學任務(wù)、保證教學質(zhì)量的基礎(chǔ)上，課堂上選擇重點、有代表性的實驗內(nèi)容完成，其他內(nèi)容作為選做實驗或開放實驗環(huán)節(jié)，供學生課后完成。

藥物代謝動力學研究內(nèi)容中的“組織分布”內(nèi)容，課堂上完成心、肝、脾、肺、腎、胃腸道、腦等組織的取材，供學生課后進行組織中藥物濃度的測定，以了解藥物在體內(nèi)的主要分布組織。

液質(zhì)聯(lián)用分析方法學部分，將線性關(guān)系考察、樣品前處理及樣品測定作為重點掌握的內(nèi)容。儀器結(jié)構(gòu)介紹、工作原理、使用注意事項、等相關(guān)知識點作為學生課前預習內(nèi)容。一般方法學分析包括：線性關(guān)系的考察、色譜、質(zhì)譜條件的優(yōu)化，專屬性、穩(wěn)定性、精密度、回收率等實驗[10-12]。課題組前期通過大量預實驗完成了該化合物含量測定的方法學研究，檢測方法靈敏、穩(wěn)定、可靠。為了讓學生完整、系統(tǒng)了解分析方法的建立，線性關(guān)系內(nèi)容之外的部分由學生課后參與或獨立完成。

4.3 數(shù)據(jù)分析及報告撰寫

(1)標準曲線的配制及樣品血藥濃度的測定。實驗結(jié)果由帶教老師整理，學生根據(jù)吡喹酮類似物及內(nèi)標的峰面積，通過Excel、Graphpad Prism 5等軟件繪制標準曲線并建立線性回歸，各時間點的血藥濃度根據(jù)標準曲線求得。通過對標準曲線結(jié)果的分析，學生可以探討標準曲線的濃度范圍及梯度設(shè)置是否合理,通過何種指標判斷線性關(guān)系是否良好，跟哪些操作過程有關(guān)。

(2)藥物代謝動力學參數(shù)計算。學生可以根據(jù)所學理論知識利用公式進行計算，該方法的優(yōu)勢在于可以幫助學生加深藥物代謝動力學概念的理解及公式的推導計算過程。此外，也可以通過藥物代謝動力學數(shù)據(jù)處理軟件DAS2.0等進行計算，該方法可以幫助學生掌握藥物代謝動力學軟件的使用，迅速得到相應(yīng)的藥物代謝動力學參數(shù)，另一方面可以驗證公式推導的計算結(jié)果是否正確，準確分析藥物的體內(nèi)過程，大大提高教學效率及質(zhì)量。

(3)實驗報告。實驗完成后學生需撰寫實驗報告，并就實驗中存在的問題進行交流和討論，總結(jié)實驗的得失。例如，按照新藥指導原則，采樣時間點的設(shè)計應(yīng)兼顧藥物的吸收相、平衡相(峰濃度附近)和消除相。一般在吸收相至少需要2～3個采樣點，整個采樣時間至少應(yīng)持續(xù)到3～5個半衰期，或持續(xù)到血藥濃度為Cmax的1/10～1/20。從圖2來看，取血時間點欠佳，應(yīng)考慮增加吸收相的取血點；由表3可見，藥物血漿半衰期t1/2z=9.569±8.077 h，而取樣時間只到6 h，應(yīng)延長采血時間，保證結(jié)果的可靠性。該過程需要學生對實驗過程進行深層次的思考，綜合運用知識分析問題，對學生的思維能力、信息處理能力及表達能力有較好的鍛煉。

5 結(jié) 語

隨著素質(zhì)教育的提出，以大型精密儀器為教學平臺，結(jié)合科學研究熱點內(nèi)容，引入新技術(shù)新方法，不斷優(yōu)化教學內(nèi)容，探索新的教學方法，已成為高校教學改革的趨勢[13-15]。該類型設(shè)計性實驗已在我院本科教學過程中順利開展，取得了不錯的教學效果。課程結(jié)合學院在藥物化學方面的科研成果，以評價新化合物的臨床前藥理學研究為內(nèi)容，更好地激發(fā)了學生的學習熱情。通過引入液相、串聯(lián)質(zhì)譜、高速冷凍離心機等大型、精密分析儀器進行實驗教學，不僅提高了大型儀器利用率，更拓展了學生視野，為培養(yǎng)高素質(zhì)掌握現(xiàn)代分析技術(shù)的藥學人才創(chuàng)造了條件[16]。通過實驗方案設(shè)計、分析解決實驗過程中遇到的問題，以及對結(jié)果的處理分析等環(huán)節(jié)的鍛煉，切實提高了學生科研創(chuàng)新能力及解決制藥工程實際問題的能力。