李紅梅, 張勤奮, 李茵茵, 張楚英, 張子健, 張以順

(中山大學(xué) a.生命科學(xué)學(xué)院；b.華南腫瘤學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，腫瘤防治中心，廣州 510275)

0 引 言

光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡都是探索微觀生命活動的重要工具，并提供了豐富的蛋白質(zhì)定位、動力學(xué)以及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)等信息[1]。自17世紀(jì)光學(xué)顯微鏡誕生以來，顯微鏡就一直是生物學(xué)家從事研究、探尋生命奧秘必不可少的利器[2-3]。透射電子顯微鏡的特點(diǎn)是分辨率高，對細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)觀察具有極大的優(yōu)勢，但缺點(diǎn)是沒法觀察活細(xì)胞、景深和觀察范圍小[1-3]。相反，光學(xué)顯微鏡具有景深大、觀察范圍廣，能進(jìn)行活細(xì)胞觀察等特點(diǎn)[4-5]，結(jié)合免疫熒光技術(shù)在以蛋白、脂質(zhì)或者離子作為靶標(biāo)來探索細(xì)胞生理活動，其應(yīng)用幾乎滲透到所有的細(xì)胞和分子生物學(xué)中，在細(xì)胞結(jié)構(gòu)或組分的定位與半定量研究、活細(xì)胞在時間軸上的變化、脂膜的流動性分析、藥物篩選等方面研究有著重要貢獻(xiàn)[6-7]；激光共聚焦顯微鏡和超高分辨顯微鏡還可以獲得三維的圖像[7-8]，可以更好地了解細(xì)胞活動過程。跟其他儀器一樣，光學(xué)顯微鏡也有其技術(shù)缺陷，與透射電鏡相比，最突出的一點(diǎn)是其分辨率不夠高，普通光學(xué)顯微鏡的極限分辨率是200 nm，幾經(jīng)發(fā)展，目前超高分辨熒光顯微鏡的分辨率提高了一個數(shù)量級，達(dá)到10 nm左右[9-11]。因此，光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡的聯(lián)用(光電聯(lián)用)能很好地彌補(bǔ)各自的缺點(diǎn)，可在原位獲得更多更全面、更精細(xì)和高分辨的細(xì)胞信息，近年來受到了廣泛的關(guān)注，尤其是冷凍光電聯(lián)用快速發(fā)展，也出現(xiàn)了一些尚未完全成熟且價格昂貴的光電聯(lián)用配套設(shè)備?？傮w而言，光電聯(lián)用技術(shù)對生命科學(xué)相關(guān)學(xué)科非常重要，但該技術(shù)還在不斷發(fā)展中。

本文嘗試使用大多數(shù)生命科學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)室能得到的光學(xué)顯微鏡和最常用的生物電鏡設(shè)備，進(jìn)行光電聯(lián)用，對處于分裂中期(M期)細(xì)胞進(jìn)行觀察。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

采用刻有網(wǎng)格標(biāo)記的培養(yǎng)皿μ-Slide CorrSight Live(ibidi，德國)培養(yǎng)細(xì)胞。培養(yǎng)皿共6個孔，每個孔中有橫向編號A-Z-a-e共31個數(shù)字，縱向編號從1～30，共900個小格，每個小格長度為100 μm，小格中可容納多個細(xì)胞。使用加有血清的普通細(xì)胞培養(yǎng)基(Gibico)。細(xì)胞采用已有穩(wěn)定表達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留綠色熒光蛋白ER-EGFP 和融合紅色熒光的組蛋白H2B-mCherry的HeLa細(xì)胞。通過胸腺嘧啶核苷雙阻斷法配合RO3306阻滯釋放獲得分裂中期(M期)細(xì)胞。

1.2 光學(xué)顯微鏡觀察

首先在倒置熒光顯微鏡(IX73，OLYMPUS)的透射光明場下觀察，物鏡為10×PH。初步觀察細(xì)胞分布情況后，再在配有數(shù)值，孔徑為100×/1.49的油浸透鏡和固體激光器(488、561、647 nm)的超分辨顯微鏡(Nikon)上觀察，用ORCA-Flash 4.0(HAMAMATSU)數(shù)碼相機(jī)采集熒光圖像(見圖1)，并且記錄目標(biāo)細(xì)胞所處的網(wǎng)格位置。再根據(jù)在超分辨顯微鏡觀察記錄的信息返回倒置顯微鏡，獲取更加詳細(xì)的定位信息，包括周圍細(xì)胞形態(tài)、數(shù)目分布等環(huán)境信息。

1.3 透射電鏡樣品制備及觀察

將上述帶有目標(biāo)細(xì)胞的培養(yǎng)皿，連同上面的培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行原位樣品制備，用2.5%戊二醛2%多聚甲醛混合固定液4℃固定過夜后，吸棄廢液，用PBS(0.1 mol/L, pH 7.4)洗3次；1%的四氧化鋨(OSO4)常溫下固定1 h；回收OSO4廢液；再次用磷酸鹽緩沖液(PBS)(0.1 mol/L, pH 7.4)洗滌3次，每次10 min；乙醇溶液梯度脫水；濃度從低到高的SPI-812環(huán)氧樹脂進(jìn)行滲透后，將事先用0.5 mL離心管盛裝的樹脂聚合成棒的粗的一頭削平，并輕輕倒扣在培養(yǎng)皿，接觸培養(yǎng)皿中的包埋劑(盡量避免氣泡產(chǎn)生)。由于其直徑和所使用的培養(yǎng)皿孔的差不多，樹脂棒一般在皿口位置，不會接觸細(xì)胞。放置于烘箱60℃聚合24 h。

圖1 熒光顯微鏡和透射電子顯微鏡在細(xì)胞觀察中聯(lián)用的實(shí)驗(yàn)過程

聚合好的樹脂通過先加熱后放進(jìn)液氮中冷卻的方法，將原來用于支持細(xì)胞的培養(yǎng)皿材料從聚合好的樣品塊剝離，借助網(wǎng)格標(biāo)記鎖定目標(biāo)細(xì)胞，用削塊機(jī)修去多余的部位。在超薄切片機(jī)(Leica EM UC6)用鉆石刀(Diatome)切成約100 nm厚的超薄切片。經(jīng)2%的醋酸雙氧鈾和3%檸檬酸鉛雙染色。最后在透射電鏡(JEM-1400)下觀察。整個過程的流程圖見圖1。

2 結(jié)果和討論

2.1 光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果

首先在倒置熒光顯微鏡的明場下觀察，可看到所培養(yǎng)的細(xì)胞少部分呈分散分布，大部分成團(tuán)單層分布，一個小格可有多個細(xì)胞(圖2(a))。雖然在同一培養(yǎng)皿中加入藥物處理細(xì)胞，但并不是所有的細(xì)胞都被阻斷在M期，有的細(xì)胞仍處在分裂間期。熒光顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)，M期細(xì)胞所占比例并不高。分裂間期的細(xì)胞有明顯的細(xì)胞核，部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)緊緊圍繞在細(xì)胞核周圍(圖2(b))。進(jìn)入M期的細(xì)胞，細(xì)胞核內(nèi)的遺傳物質(zhì)聚集形成多個小團(tuán)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)繞著成團(tuán)的染色體存在(圖2(b))。

圖2 光學(xué)顯微鏡下的細(xì)胞分布、形態(tài)結(jié)構(gòu)

(a)倒置顯微鏡下的細(xì)胞分布；(b)圖(a)局部放大圖；(c)左側(cè)細(xì)胞為分裂間期細(xì)胞，右側(cè)為M期細(xì)胞?？梢钥吹組期細(xì)胞中染成紅色的組蛋白成團(tuán)塊狀分布在細(xì)胞中，周圍有綠色標(biāo)記的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分布。綠色EGFP標(biāo)記內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；紅色mCherry標(biāo)記組蛋白

2.2 透射電鏡觀察結(jié)果

透射電鏡下，同樣可以觀察到兩種細(xì)胞形態(tài)同時存在。處于分裂間期的細(xì)胞(見圖3(a)，3(b))和處于細(xì)胞分裂M 期的細(xì)胞(見圖3(c)，3(d))。電鏡中觀察可發(fā)現(xiàn)兩種狀態(tài)細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)長度具有明顯不同。分裂間期細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相對短，且有的地方內(nèi)質(zhì)網(wǎng)成鎖鏈狀，也沒有形成片層狀結(jié)構(gòu)環(huán)繞細(xì)胞核。而M期細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相對較長，成片層狀結(jié)構(gòu)環(huán)繞著細(xì)胞核物質(zhì)分布；此外，細(xì)胞內(nèi)的線粒體、溶酶體等結(jié)構(gòu)也可以在電鏡圖像中觀察到。有些線粒體發(fā)生空泡化現(xiàn)象，這些可能與實(shí)驗(yàn)中使用藥物或培養(yǎng)時間過長有關(guān)。

圖3 電鏡下HeLa細(xì)胞被阻斷在分裂中期和在分裂間期的細(xì)胞形態(tài)

(a)分裂間期細(xì)胞。(b)圖(a)細(xì)胞的局部放大，可見線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和溶酶體等。(c)M期細(xì)胞；(d)圖(c)局部放大。N：細(xì)胞核，黑色箭頭：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，白色箭頭：溶酶體，五角星號：染色體，M：線粒體

2.3 光電聯(lián)用觀察結(jié)果

為了把光學(xué)顯微鏡和電鏡觀察結(jié)果對應(yīng)起來，實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行了光電聯(lián)用的嘗試。首先借助熒光標(biāo)記，在488 nm和561 nm波長的激發(fā)光下可以看到紅色熒光蛋白標(biāo)記的染色體/染色質(zhì)和綠色熒光蛋白標(biāo)記的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，通過超高分辨顯微鏡找到被阻滯在M期的細(xì)胞，采用ORCA-Flash 4.0數(shù)碼相機(jī)采集熒光圖像(圖4(a))，同時記下該細(xì)胞所在位置(D孔21CD小格間)。從熒光圖像可以看到目標(biāo)細(xì)胞的染色體和包繞在其周圍的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。轉(zhuǎn)換到在倒置顯微鏡，在D孔21CD間的位置找到目標(biāo)細(xì)胞，觀察細(xì)胞所處環(huán)境(圖4(b))，該處周圍有3團(tuán)細(xì)胞，目標(biāo)細(xì)胞處于其中一個細(xì)胞團(tuán)的邊緣，目標(biāo)細(xì)胞相鄰的一團(tuán)細(xì)胞有個較大的梭形細(xì)胞，其形態(tài)特殊，可作為突出標(biāo)志幫助后續(xù)定位。而后經(jīng)過原位固定、脫水和包埋聚合。切片前，首先根據(jù)培養(yǎng)皿標(biāo)記，確定靶標(biāo)細(xì)胞所在部位，定位后對周圍進(jìn)行修塊處理，最后進(jìn)行超薄切片，染色后透射電子顯微鏡下觀察。電鏡下已不可能有培養(yǎng)皿的網(wǎng)格標(biāo)記，此時倒置熒光顯微鏡下觀察到的細(xì)胞的形態(tài)及其周圍細(xì)胞的形態(tài)、分布可作為依據(jù)，幫助找到對應(yīng)的目標(biāo)細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)倒置熒光顯微鏡下看到的那個大梭形細(xì)胞就可用來作為輔助靶標(biāo)，幫助確定最后目標(biāo)細(xì)胞(圖4(c))。實(shí)驗(yàn)中該目標(biāo)細(xì)胞的結(jié)果顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)長長地包繞在染色體外(圖4(d))，這些結(jié)果跟熒光顯微鏡觀察的結(jié)果一致。同時，電鏡下還觀察到目標(biāo)細(xì)胞具有呈典型的M期細(xì)胞特征，細(xì)胞核內(nèi)染色體結(jié)構(gòu)明顯，核周沒有明顯的核膜結(jié)構(gòu)。此外還可看到細(xì)胞內(nèi)的線粒體等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

圖4 光電聯(lián)用實(shí)驗(yàn)結(jié)果

(a)超高分辨顯微鏡獲得的M期細(xì)胞，綠色：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；紅色：染色體。(b)經(jīng)戊二醛固定后在倒置顯微鏡獲得的圖像，目標(biāo)細(xì)胞在21排的C和D列間(箭頭所示)，在其右側(cè)(21D)有一個圓的細(xì)胞和一個梭形細(xì)胞(三角形箭頭)。(c)透射電鏡較低倍數(shù)的圖像。圖中有個明顯的梭形細(xì)胞(三角形箭頭)，下方有3個細(xì)胞，根據(jù)(b)圖可以確定箭頭所示的目標(biāo)細(xì)胞；(d)目標(biāo)細(xì)胞的常規(guī)電鏡圖像

3 結(jié) 語

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，利用有標(biāo)記的細(xì)胞培養(yǎng)皿、常規(guī)化學(xué)固定、常溫常規(guī)光學(xué)顯微鏡和電鏡等耗材和設(shè)備，可以進(jìn)行光電聯(lián)用的研究并成功獲得結(jié)果。這對大多數(shù)農(nóng)林、生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)等相關(guān)學(xué)科的普通電鏡使用來說，一方面可以幫助獲得一些重要的結(jié)果；另一方面，本實(shí)驗(yàn)使用的方法具有方便、成本低、易操作等特點(diǎn)，可以一定程度上為缺乏冷凍電鏡和冷凍光電聯(lián)用設(shè)備實(shí)驗(yàn)室提供解決很多科研問題的新方法。