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        碳源對(duì)杜氏鹽藻株生長(zhǎng)的影響及其培養(yǎng)基的優(yōu)化

        2019-12-20 05:59:54王玲玲李兆河馬貴范王吝安
        水產(chǎn)學(xué)雜志 2019年6期
        關(guān)鍵詞:乙酸鈉微藻碳源

        王玲玲,李兆河,馬貴范,王吝安

        (1.威海海洋職業(yè)學(xué)院,威海市微藻種質(zhì)資源開(kāi)發(fā)工程技術(shù)研究中心,山東 榮成 264300;2.山東大學(xué)(威海)海洋學(xué)院,山東 威海 266071)

        杜氏鹽藻Dunaliella salina 富含蛋白質(zhì)、β-胡蘿卜素和特殊生物活性物質(zhì),在食品、醫(yī)療保健、化工和養(yǎng)殖業(yè)中具有公認(rèn)的獨(dú)特經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]。筆者由山東榮成桑溝灣分離得到一株具有優(yōu)良性狀的鹽藻,用混合營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)方法研究了碳酸氫鈉、葡萄糖、蔗糖和乙酸鈉等碳源和濃度對(duì)其生長(zhǎng)的影響;采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)方法優(yōu)化了其培養(yǎng)基中C、N、P 的濃度水平,為鹽藻大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        實(shí)驗(yàn)用鹽藻分離于山東省榮成桑溝灣自然水域,經(jīng)分子鑒定為杜氏鹽藻。

        葡萄糖、蔗糖、乙酸鈉、碳酸氫鈉、硝酸鈉、磷酸二氫鈉和硅酸鈉等為分析純?cè)噭?/p>

        培養(yǎng)用水為取自山東榮成桑溝灣海區(qū)鹽度31.5 的自然海水,0.45μm 微孔濾膜抽濾,用氯化鈉調(diào)整海水鹽度至60;培養(yǎng)基采用f/2 培養(yǎng)基[2]。培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后冷卻曝氣,調(diào)pH 至8.0;鹽藻置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),溫度26℃,光暗比12h∶12h,光照強(qiáng)度3 000~4 000Lux,每8h 振蕩1 次。

        1.2 方法

        1.2.1 碳源的篩選

        將無(wú)機(jī)碳源(碳酸氫鈉)、有機(jī)碳源(葡萄糖、蔗糖和乙酸鈉)分別加入f/2 培養(yǎng)基中,每種碳源設(shè)4個(gè)碳素濃度梯度,分別為0.00 mol·L-1(對(duì)照組)、0.05 mol·L-1、0.10 mol·L-1和0.15mol·L-1。實(shí)驗(yàn)采用一次性培養(yǎng)方式,在250mL 三角瓶中裝入150mL培養(yǎng)液,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期藻種接種,接種密度為0.61×106ind.·mL-1,培養(yǎng)12d,每24h 定時(shí)采樣記錄鹽藻的細(xì)胞密度。

        1.2.2 鹽藻培養(yǎng)基的優(yōu)化

        根據(jù)碳源篩選結(jié)果和f/2 培養(yǎng)基配方,以葡萄糖、硝酸鈉和磷酸二氫鈉為碳、氮和磷源,設(shè)計(jì)三因素三水平L9(34)正交試驗(yàn)[3],優(yōu)化鹽藻培養(yǎng)基中C、N、P 營(yíng)養(yǎng)鹽濃度,各因素水平如表1 所示。培養(yǎng)12d,每24h 定時(shí)采樣記錄鹽藻的細(xì)胞密度。

        表1 三種營(yíng)養(yǎng)鹽因素水平表Tab.1 Levels of three nutrients(g·L-1)

        1.3 鹽藻細(xì)胞密度的測(cè)定

        用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)鹽藻的細(xì)胞密度,用V-2000 分光光度計(jì)測(cè)定相應(yīng)細(xì)胞密度下藻液的OD630,每隔24h 測(cè)定一次,繪制吸光度與藻細(xì)胞濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出鹽藻細(xì)胞密度[4]。

        1.4 數(shù)據(jù)分析

        實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,運(yùn)用SPSS 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。選擇單因變量多因素方差法分析碳源形式和濃度的主效應(yīng)和二者的交互效應(yīng);對(duì)方差分析結(jié)果顯著的因素,利用最小顯著差數(shù)法(LSD)進(jìn)行多重比較[5]。正交試驗(yàn)采用直觀分析和單因變量多因素方差法分析C、N、P 的主效應(yīng)。差異顯著性水平為P<0.050。

        2 結(jié)果和分析

        2.1 不同碳源對(duì)鹽藻生長(zhǎng)的影響

        如圖1~4 所示,培養(yǎng)1~3d 為延緩期,第4d 進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期,第10~12d 細(xì)胞密度最高。如圖1 所示,第12d 空白對(duì)照組鹽藻細(xì)胞密度為(5.40±0.42)×106ind.·mL-1,葡萄糖組0.05mol·L-1、0.10mol·L-1和0.15mol·L-1濃度下鹽藻細(xì)胞的密度高于空白對(duì)照組,且0.10mol·L-1濃度下細(xì)胞密度為(12.56±0.44)×106mL-1,較0.05mol·L-1和0.15 mol·L-1濃度下細(xì)胞密度高;如圖2 所示,第12d 蔗糖組0.05mol·L-1、0.10mol·L-1和0.15mol·L-1濃度下鹽藻細(xì)胞密度高于空白對(duì)照組,且0.05mol·L-1濃度下細(xì)胞密度為(9.29±0.21)×106ind.·mL-1,較0.10mol·L-1和0.15mol·L-1濃度下細(xì)胞密度高;如圖3 所示,第12d乙酸鈉組0.05mol·L-1、0.10mol·L-1和0.15mol·L-1濃度下鹽藻細(xì)胞密度低于空白對(duì)照組,0.05mol·L-1濃度下細(xì)胞密度為(4.89±0.22)×106ind.·mL-1,較0.10mol·L-1和0.15mol·L-1濃度下細(xì)胞密度高;如圖4 所示,第12d 碳酸氫鈉組0.05mol·L-1、0.10mol·L-1和0.15mol·L-1濃度下的鹽藻細(xì)胞密度高于空白對(duì)照組,且0.15 mol·L-1濃度下細(xì)胞密度為(8.04±0.22)×106ind.·mL-1,較0.05mol·L-1和0.10mol·L-1濃度下細(xì)胞密度高。結(jié)果顯示,各試驗(yàn)濃度葡萄糖、蔗糖和碳酸鈉均可促進(jìn)鹽藻的生長(zhǎng),乙酸鈉抑制鹽藻的生長(zhǎng)。

        圖1 不同的葡萄糖濃度下鹽藻的生長(zhǎng)曲線(n=3)Fig.1 The growth curves of green alga Dunaliella salina at different concentrations of glucose C6H12O6

        圖2 不同的蔗糖濃度下鹽藻的生長(zhǎng)曲線(n=3)Fig.2 The growth curves of green alga Dunaliella salina at different concentrations of sucrose C12H22O11

        圖3 不同的乙酸鈉濃度下鹽藻的生長(zhǎng)曲線(n=3)Fig.3 The growth curves of green alga Dunaliella salina with Different concentrations of CH3COONa

        圖4 不同的碳酸氫鈉濃度下鹽藻的生長(zhǎng)曲線(n=3)Fig.4 The growth curves of green alga Dunaliella salina at different concentrations of NaHCO3

        由圖5 可知,第12d,0.05mol·L-1濃度下葡萄糖組與蔗糖組的細(xì)胞密度相差不大,且明顯高于碳酸鈉和乙酸鈉組;0.10mol·L-1與0.15mol·L-1濃度下,鹽藻的細(xì)胞密度由高至低為:葡萄糖組>蔗糖組>碳酸鈉組>乙酸鈉組。

        圖5 不同碳源條件下鹽藻生長(zhǎng)的細(xì)胞密度Fig.5 The cell density of green alga Dunaliella salina with different carbon sources

        SPSS 的一般線性模型方差分析結(jié)果顯示:碳源和濃度都對(duì)鹽藻生長(zhǎng)的細(xì)胞密度有極顯著影響(P=0.000)(表2)。多重比較結(jié)果顯示,有利于鹽藻細(xì)胞密度增加的碳源形式表現(xiàn)為:葡萄糖>蔗糖>碳酸鈉>乙酸鈉,四者之間差異極顯著;有利于鹽藻細(xì)胞密度增加的碳濃度表現(xiàn)為:0.10mol·L-1>0.05 mol·L-1≥0.15mol·L-1>0.00mol·L-1,其中0.05mol·L-1和0.15mol·L-1組別差異不顯著(P=0.502)。有利于鹽藻細(xì)胞密度增加,優(yōu)選葡萄糖做碳源,適宜濃度為0.10mol·L-1。

        表2 碳源形式和濃度對(duì)鹽藻的細(xì)胞密度的主效應(yīng)和交互效應(yīng)檢驗(yàn)Tab.2 Analysis of main and interaction effects of carbon sources and concentration on final cell density

        2.2 鹽藻培養(yǎng)基的優(yōu)化

        2.2.1 極差分析

        如表3 正交試驗(yàn)分析所示,經(jīng)12d 培養(yǎng),各營(yíng)養(yǎng)鹽極差分析結(jié)果為:N 源>C 源>P 源,各營(yíng)養(yǎng)鹽對(duì)鹽藻細(xì)胞密度增加的影響由大到小依次為:N源、C 源、P 源;C 源各水平的影響由大到小依次為:K2>K3>K1;N 源各水平的影響由大到小依次為:K3>K2>K1;P 源各水平的影響由大到小依次為:K3>K2>K1。直觀分析鹽藻優(yōu)化后的培養(yǎng)基成分為:葡萄糖(C 源)18.00g·L-1、硝酸鈉(N 源)0.1000g·L-1和磷酸二氫鈉(P 源)0.0075g·L-1。

        表3 營(yíng)養(yǎng)鹽對(duì)鹽藻細(xì)胞密度增加的影響正交試驗(yàn)結(jié)果分析Tab.3 Result analysis of the orthogonal tests on effects of nutrients on cell density of green alga Dunaliella salina

        2.2.2 方差分析

        由表4 可知,氮源、碳源對(duì)鹽藻細(xì)胞密度增加的影響顯著(P<0.050),磷源的影響不顯著(P>0.050)。各營(yíng)養(yǎng)鹽對(duì)鹽藻細(xì)胞密度增加的影響顯著性由大到小依次為:氮源、碳源、磷源。方差分析的結(jié)果與直觀分析的結(jié)果一致。

        表4 方差分析結(jié)果Tab.4 Results of variance analysis

        3 討論

        微藻富含脂類、蛋白質(zhì)和多糖,光合作用效率高、生長(zhǎng)周期短、可再生,在食品、醫(yī)藥、保健品及生物能源領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[6,7]。人工大規(guī)模高效培養(yǎng)是微藻資源開(kāi)發(fā)利用的關(guān)鍵。近年來(lái),隨著許多藻類利用碳源的研究不斷深化,圍繞微藻異養(yǎng)或混養(yǎng)的研究逐漸展開(kāi)[8]。研究表明:混合營(yíng)養(yǎng)(Mixo-trophism)(同時(shí)進(jìn)行無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)光合作用與有機(jī)營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)方式)可以大規(guī)模高密度生產(chǎn)微藻[9]。微藻可以吸收利用水體中的HCO3-[10]。White 等[11]發(fā)現(xiàn),添加1g/L 碳酸氫鈉可以提高四爿藻Tetraselmis suecica 和微綠球Nannochloropsis salina 的細(xì)胞密度;戴玉蓉和盧敬讓[12]在培養(yǎng)液中添加1g/L NaHCO3,明顯促進(jìn)了綠色巴夫藻3012 Pavlova viridis、亞心扁藻Platymonas subcordiformis、海水小球藻Chlorella pacifica、等鞭金藻8701 和等鞭金藻3011 的生長(zhǎng);王星宇等[13]研究發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)液中添加碳酸氫鈉顯著影響球等鞭金藻的生長(zhǎng)。

        微藻細(xì)胞對(duì)有機(jī)碳化合物及其利用程度也具有偏愛(ài)性[14]。Pruvost 等[15]報(bào)道,某些微藻具有特殊的運(yùn)送系統(tǒng),可主動(dòng)吸收培養(yǎng)基中的有機(jī)化合物,這為微藻異養(yǎng)或混合培養(yǎng)提供了依據(jù)。目前藍(lán)藻門、隱藻門、甲藻門、金藻門、黃藻門、硅藻門、裸藻門和綠藻門等8 門60 多屬的近百種微藻可以進(jìn)行異養(yǎng)或混合營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)[16],其中某些微藻經(jīng)過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)后,生物量或有用生化產(chǎn)物大幅提高。吳慶余等[17]用批式流加葡萄糖培養(yǎng)原始小球藻Eprotothecoides,生物量超過(guò)了100g·L-1。降低鹽藻培養(yǎng)液中可溶性無(wú)機(jī)碳源含量,增加葡萄糖混合培養(yǎng)基顯著影響杜氏鹽藻的生長(zhǎng)[18];葡萄糖濃度為30 mmol·L-1時(shí),微綠球藻Nannochloropsis sp 的生長(zhǎng)明顯增長(zhǎng)[19]。田華等[20]研究葡萄糖碳源對(duì)螺旋藻Spirulinaplatensis 的混合營(yíng)養(yǎng),發(fā)現(xiàn)葡萄糖濃度為3.0g·L-1時(shí),干重是對(duì)照的1.29 倍。這些異養(yǎng)微藻已用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn),其應(yīng)用價(jià)值主要表現(xiàn)在作為水產(chǎn)餌料和提取生化產(chǎn)物[21]。

        本試驗(yàn)明確了培養(yǎng)液中適合鹽藻混合培養(yǎng)的最優(yōu)碳源為葡萄糖,與孫俊楠等[18]的研究結(jié)果相似;優(yōu)化后的培養(yǎng)基中C、N、P 營(yíng)養(yǎng)鹽濃度為:葡萄糖18.00g·L-1,硝酸鈉0.1000g·L-1,磷酸二氫鈉0.0075 g·L-1,優(yōu)化的培養(yǎng)基明顯提高了鹽藻的生長(zhǎng)量,可為鹽藻的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。為擴(kuò)大應(yīng)用范圍,在本研究的基礎(chǔ)上,未來(lái)將進(jìn)一步探討不同碳源、濃度與鹽藻的細(xì)胞化學(xué)組成的關(guān)系及其影響機(jī)制等。

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