石和榮，何琪，呂晴霽，彭激夫，梁添發(fā)，陳奕彬，柳小春，楊宇晴，劉蘇，張海發(fā)，王慶，趙會(huì)宏

（1.廣東省海洋漁業(yè)試驗(yàn)中心，廣東 惠州 516081；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，廣東 廣州 510640；3.廣東天地本草飼料科技有限公司，廣東 中山 528400）

虎龍雜交石斑魚（Epinephelus fuscoguttatus♀×E.lanceolatus♂）生長快、成活率高、肉質(zhì)鮮美人工養(yǎng)殖得到了快速發(fā)展[1]。但隨著石斑魚養(yǎng)殖業(yè)集約化養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，近海污染嚴(yán)重，養(yǎng)殖過程中疾病頻發(fā)，抗生素或化學(xué)藥物的濫用等對(duì)環(huán)境和人類健康產(chǎn)生了不良影響，嚴(yán)重制約了石斑魚養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[2]。

中草藥是一種天然綠色飼料添加劑，包含生物堿、多糖、有機(jī)酸、揮發(fā)油等多種活性成分[3]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)黃芪Astragalus membranaceus、板藍(lán)根Baphicacanthus cusia、金銀花Lonicera japonica 等多種中草藥能不同程度地提高水產(chǎn)動(dòng)物的免疫力及生長性能[4,5]。如李華等[6]研究發(fā)現(xiàn)，投喂一定量的牛膝等中草藥可顯著提高大菱鲆Scophthalmus maximus 的免疫力。核苷酸被稱為條件營養(yǎng)物質(zhì)，當(dāng)動(dòng)物體內(nèi)源核苷酸合成不足時(shí)，需要來源于飼料的外源核苷酸加以補(bǔ)充，是一種新型綠色飼料添加劑[7]。目前，飼料中添加核苷酸對(duì)奧尼羅非魚（Oreochromis niloticus×O.areus）[8]、大菱鲆[9]等養(yǎng)殖魚類生長及免疫的影響已有報(bào)道。大多數(shù)研究表明：飼料中添加核苷酸能進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物的生長發(fā)育，提高其免疫力?；堧s交斑是近年推廣的水產(chǎn)養(yǎng)殖石斑魚品種，關(guān)于中草藥或核苷酸對(duì)其作用效果報(bào)道較少。

本試驗(yàn)通過研究在飼料中添加一種復(fù)方中草藥或核苷酸對(duì)虎龍雜交石斑魚生長及免疫功能的影響，以期為探索虎龍雜交斑循環(huán)水養(yǎng)殖中的病害防控技術(shù)，提高石斑魚循環(huán)水養(yǎng)殖的存活率和抗病力，以及探究水產(chǎn)動(dòng)物的高效養(yǎng)殖提供思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料

石斑魚基礎(chǔ)料（RUBY 牌）委托廣東越群飼料公司定制（表1）；復(fù)合中草藥添加劑由板藍(lán)根、黃岑、黃芪、忍冬藤、白芷、甘草共6 種中草藥按比例為1∶1∶1∶1∶1∶1 復(fù)配而成（由廣東天地本草飼料科技有限公司提供），經(jīng)中藥粉末專用氣旋篩粉機(jī)加工，細(xì)度達(dá)到300 目。核苷酸（瑞士CHEMOFORMA 公司提供）由純化胞苷酸、純化腺苷酸、純化胸苷酸、純化鳥苷酸、純化鳥苷酸、純化核糖核酸按等質(zhì)量比例（1∶1∶1∶1∶1∶1）復(fù)配而成。添加劑先與粘合劑混勻（粘合劑為a-淀粉，兩者比例為1∶0.2），然后在基礎(chǔ)飼料中分別加入2 g/kg、4 g/kg復(fù)合中草藥添加劑和4 g/kg 核苷酸添加劑，混合均勻，噴灑少量水霧，使其與飼料粘合，經(jīng)小型制粒機(jī)制成粒徑為3 mm 的顆粒型膨化飼料，風(fēng)干后置于-4℃的冰箱中冷藏，保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 基礎(chǔ)飼料組成和營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）Tab.1 Ingredient and utrition level of basal feed（on airdry basis）

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)管理

試驗(yàn)在廣東省海洋漁業(yè)試驗(yàn)中心的室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行。試驗(yàn)開始前，將平均質(zhì)量（22.36±0.07）g 的試驗(yàn)魚饑餓24h，挑選由中心提供的600 尾大小均勻、健康的雜交石斑魚放養(yǎng)于12個(gè)養(yǎng)殖桶中（有效養(yǎng)殖水體0.55 m3），每桶50 尾，隨機(jī)分為4 組，每組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。馴化一周后開始正式試驗(yàn)。正式試驗(yàn)時(shí)，每天早上8:30 和下午4:30各飽食投喂1 次，攝食5min 后，在養(yǎng)殖桶或網(wǎng)內(nèi)設(shè)置投料籃，收集殘餌，記錄殘餌數(shù)量。每日記錄各試驗(yàn)組投餌量、死亡率等，養(yǎng)殖周期為56 d。整個(gè)養(yǎng)殖過程中水溫為27.05～31.05℃，溶解氧為5.40～7.70mg/L，pH 為7.50～8.20，氨氮濃度小于0.3mg/L。

1.3 樣品采集與處理

采樣前停喂24h，將養(yǎng)殖桶內(nèi)的試驗(yàn)魚全部撈出，統(tǒng)計(jì)尾數(shù)和試驗(yàn)魚總質(zhì)量。從每個(gè)養(yǎng)殖桶中隨機(jī)選取20 尾魚測(cè)量體質(zhì)量、體長等生長性能指標(biāo)。然后，用1.0mL 的注射器抽取尾靜脈血液，注射于1.5mL 的離心管中，4 ℃下靜置4h 后，以5 000r/min離心10min，取上層清液分裝0.5mL 的離心管中，置于-80℃保存?zhèn)溆?。用?jīng)過滅菌滅酶處理的采樣工具按順序解剖稱量內(nèi)臟和肝臟質(zhì)量，并將其前腸與肝胰臟、脾臟、腎臟三個(gè)免疫器官分別放入2mL 離心管中于液氮中速凍，保存于-80℃冰箱中備用。再將解剖后的魚去皮取背部肌肉，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 生長性能的計(jì)算

1.4.2 肌肉常規(guī)檢測(cè)

粗蛋白含量用凱氏定氮法測(cè)定，粗脂肪含量用索氏抽提法測(cè)定。

1.4.3 血清生化指標(biāo)

血清溶菌酶活性采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測(cè)定。

1.4.4 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量

采用熒光定量PCR 法測(cè)定虎龍雜交石斑魚肝胰臟、脾、腎中干擾素γ（IFN-γ）、熱休克蛋白70（HSP70）、白細(xì)胞介素β（IL-1β）相關(guān)基因的表達(dá)水平。用Magen 公司的Hipure Universal RNA Kits 試劑盒提取總RNA。用核酸濃度分析儀測(cè)定核酸溶液的A260/A280的比值即為核酸純度，其范圍在1.8～2.0之間，自動(dòng)記錄各濃度。用瓊脂凝膠法檢測(cè)RNA 的質(zhì)量。提取1μg 樣品RNA 后采用北京全式金生物技術(shù)有限公司的EasyScriptOne-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix 試劑盒（含去除基因組中殘留DNA 步驟）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。應(yīng)用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，并在NCBI/Primer-BLAST 上進(jìn)行比對(duì)，選擇特異性引物。所設(shè)計(jì)引物序列由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。PCR 引物序列見表2。以cDNA 為模板，采用熒光定量PCR 法，用北京全式金生物技術(shù)有限公司的TransScriptTip Green qPCR Super Mix 試劑盒測(cè)定肝胰腺、脾、腎、組織中白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、γ-干擾素（IFN-γ）和熱休克蛋白70（HSP70）免疫相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)水平。20 μL 的反應(yīng)體系包括：10 μL 2×TransScriptTip Green qPCR Super Mix、0.4 μL Forward Primer（10 μM）、0.4 μL Reverse Primer（10 μM）、0.4 μL Passive Reference Dye（50х）、1 μL cDNA 和7.8 μL ddH2O。反應(yīng)條件為：94℃30s、94℃5s、58℃15s、72℃10s，共40 個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品做3 次分析。采用的2-△△CT法計(jì)算各目的基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。

表2 熒光定量PCR 引物序列Tab.2 Fluorescence quantitative PCR primer sequence

所得數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SE）表示，用Excel 2018 軟件進(jìn)行處理，通過SPSS 18.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA）,并進(jìn)行Duncan 多重比較，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加復(fù)方中草藥或核苷酸對(duì)虎龍雜交石斑魚生長性能的影響

由表3 可知：添加復(fù)方中草藥或核苷酸對(duì)虎龍雜交石斑魚的體質(zhì)量增重率、特定生長率無顯著影響（P＞0.05），但顯著提高了虎龍雜交石斑魚的成活率（P＜0.05）；4g/kg 中草藥組飼料系數(shù)顯著低于2g/kg 中草藥組（P＜0.05）；4g/kg 中草藥組、4g/kg 核苷酸組肥滿度和臟體比顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；各組間虎龍雜交石斑魚肝體比無顯著差異（P＞0.05）。

2.2 添加復(fù)方中草藥或核苷酸對(duì)虎龍雜交石斑魚肌肉營養(yǎng)成分的影響

由表4 可知：添加復(fù)方中草藥或核苷酸的處理組肌肉蛋白和脂肪含量與對(duì)照組無顯著性差異（P＞0.05）。

2.3 添加復(fù)方中草藥或核苷酸對(duì)虎龍雜交石斑魚血清溶菌酶的影響

由表5 可知：添加復(fù)方中草藥或核苷酸組魚血清溶菌酶活性顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），其中4 g/kg 核苷酸組最高。

2.4 添加復(fù)方中草藥或核苷酸對(duì)虎龍雜交石斑魚免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響

飼料中添加復(fù)方中草藥或核苷酸對(duì)虎龍雜交石斑魚免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響見圖1、圖2 和圖3。添加復(fù)方中草藥或核苷酸的飼料總體上提高了虎龍雜交石斑魚3 個(gè)器官細(xì)胞因子的mRNA 表達(dá)。2g/kg 中草藥組腎臟中HSP70、IL-1β 及脾臟中IFN-γ 表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），4g/kg 中草藥組肝中IL-1β 表達(dá)量顯著高于對(duì)照組和其他試驗(yàn)組（P＜0.05）；腎臟和脾臟中IFN-γ 表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），4g/kg 核苷酸組脾中HSP70和IL-1β 表達(dá)量顯著高于對(duì)照組和其他試驗(yàn)組（P＜0.05）；脾的IFN-γ 表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

表3 飼料中添加復(fù)方中草藥或核苷酸對(duì)虎龍雜交石斑魚生長性能的影響Tab.3 Effects of dietary compound Chinese herbal medicine and nucleotides on growth performance of hybrid grouper

表4 飼料中添加復(fù)方中草藥或核苷酸對(duì)虎龍雜交石斑魚肌肉營養(yǎng)成分的影響Tab.4 Effects of dietary compound Chinese herbal medicine and nucleotides on muscular proximate composition of hybrid grouper

圖1 飼料中添加復(fù)方中草藥或核苷酸對(duì)虎龍雜交石斑魚HSP-70 表達(dá)的影響Fig.1 Effects of compound Chinese herbal medicine and nucleotides on the expression of HSP-70 in hybrid grouper

圖2 飼料中添加復(fù)方中草藥或核苷酸對(duì)虎龍雜交石斑魚IL-1β 表達(dá)的影響Fig.2 Effects of compound Chinese herbal medicine or nucleotides on the expression of IL-1β in hybrid grouper

圖3 飼料中添加復(fù)方中草藥或核苷酸對(duì)虎龍雜交石斑魚IFN-γ 表達(dá)的影響Fig.3 Effects of compound Chinese herbal medicine or nucleotides on the expression of IFN-γ in hybrid grouper

3 討論

3.1 添加復(fù)方中草藥對(duì)虎龍雜交石斑魚的影響

3.1.1 生長性能

本試驗(yàn)中，在飼料中添加含有板藍(lán)根、黃芪、黃岑等的復(fù)方中草藥，虎龍雜交石斑魚的體質(zhì)量增重率和特定生長率增加不明顯，但復(fù)方中藥的添加量為4g/kg 時(shí)，飼料系數(shù)降低了5.2%，存活率也顯著增加。這說明，飼料中添加適量的復(fù)方中草藥或核苷酸能在維持虎龍雜交石斑魚正常生長的同時(shí)，又大大增強(qiáng)了其抗病能力。徐安樂等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加含有大黃、金銀花和黃芪等的復(fù)方中草藥，對(duì)珍珠龍膽石斑魚（E.lanceolatus♂×E.fuscoguttatus♀）的促生長效果不顯著，僅降低了餌料系數(shù)。而吳彬等[11]以含有0.5%黃芩、0.5%金銀花、0.5%板藍(lán)根、0.5%黃芪等氮等能飼料分別投喂吉富羅非魚Oreochromis niloticus 幼魚發(fā)現(xiàn)，各組魚體增重、特定生長率顯著提高，飼料系數(shù)顯著降低，其中黃芪組各項(xiàng)生長指標(biāo)顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組。馬國紅等[12]探究了板藍(lán)根、黃芪、甘草等對(duì)鯉Cyprinus carpio 生長性能及其體成分的影響，認(rèn)為適宜添加復(fù)方中草藥可以促進(jìn)魚類生長，降低飼料系數(shù)。綜上所述，飼料中添加適量的中草藥能不同程度地促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物生長，而給藥劑量不同，可能與添加中草藥種類和養(yǎng)殖對(duì)象的不同有關(guān)。中草藥中含有的多糖類、有機(jī)酸、生物堿、黃酮類能增加動(dòng)物體內(nèi)紅細(xì)胞數(shù)量，促進(jìn)機(jī)體血紅蛋白、血清總蛋白的合成。中草藥可影響水產(chǎn)動(dòng)物胃腸道內(nèi)常在菌群的狀態(tài)，維護(hù)動(dòng)物腸道健康，優(yōu)化腸道對(duì)營養(yǎng)成分的吸收，促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物的健康生長[3]。

3.1.2 免疫能力

溶菌酶是一種能水解致病菌中黏多糖的堿性酶，主要來源于吞噬細(xì)胞，能破環(huán)細(xì)菌、真菌、病毒以及寄生物結(jié)構(gòu)，顯著增強(qiáng)魚體的抗病能力。溶菌酶活性的高低直接顯示溶菌作用的強(qiáng)弱，可以代表機(jī)體免疫功能的狀況[13]。研究發(fā)現(xiàn)[14]，黃芪、黃岑中含有多糖、生物堿等營養(yǎng)成分，能有效促進(jìn)相關(guān)免疫酶的合成。中草藥可提高水產(chǎn)動(dòng)物血液中溶菌酶活性的研究報(bào)道屢見不鮮。李華等[6]以牛膝、板藍(lán)根、甘草等中草藥制成免疫增強(qiáng)劑投喂大菱鲆Scophthalmus maximus，顯著提高了其溶菌酶活性。李梅芳[15]等選用黃芪、黃岑等中草藥投喂大黃魚Pseudosciaena crocea，各組魚溶菌酶活性顯著上升，這與本研究結(jié)論相似。但在本試驗(yàn)中，隨著復(fù)方中草藥含量的增加，溶菌酶活性有所減少，其原因可能與使用劑量有關(guān)，復(fù)方中草藥超過一定用量后是否會(huì)抑制血清溶菌酶的活性，有待下一步試驗(yàn)探索。

相關(guān)研究表明：復(fù)方中草藥中的某些物質(zhì)能誘導(dǎo)免疫相關(guān)基因的表達(dá)。IL-1β 作為IL 家族重要的一員，是最早表達(dá)的一個(gè)炎性細(xì)胞因子，它能誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞的生長以及分泌一些細(xì)胞因子來增強(qiáng)免疫應(yīng)答，殺滅病原，起到抗細(xì)菌、病毒、腫瘤的作用[16]。一定量的黃芪、板藍(lán)根、蒲公英等中藥多糖對(duì)IL-1β 的表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用[17]。在哺乳動(dòng)物中，IFN 可以分為α、β、γ 三種類型，三者均有抗病毒活性。其中，IFN-γ 為Ⅱ型對(duì)干擾素是一個(gè)單基因家族，在免疫調(diào)節(jié)以及炎癥反應(yīng)中起重要作用。HSP70 是熱休克蛋白家族最重要和保守的蛋白，扮演著細(xì)胞因子和分子伴侶的雙層身份。很多研究報(bào)道，HSP70 具有多種生物學(xué)活性和功能，包括分子伴侶、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、提高機(jī)體耐受力、對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)等功能[18]。帥學(xué)宏等[19]研究發(fā)現(xiàn)，青蒿多糖提高了小鼠血清中IL-1β 和IFN-γ 質(zhì)量濃度。王家敏[20]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪、當(dāng)歸等復(fù)方中草藥能誘導(dǎo)吉富羅非魚Hsp70 和IL-1β 基因在頭腎、肝臟、胸腺、鰓和脾臟組織中表達(dá)。本試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了在飼料中添加復(fù)方中草藥誘導(dǎo)虎龍雜交石斑魚IL-1β、IFN-γ、HSP70 三種免疫相關(guān)基因在腎臟、脾臟組織中的合成與分泌。

3.2 添加核苷酸對(duì)虎龍雜交石斑魚的影響

3.2.1 生長性能

核苷酸是動(dòng)物體內(nèi)不可缺少的重要部分，它廣泛參與動(dòng)物體內(nèi)供能、脂肪代謝等生命過程，提供魚體快速生長時(shí)細(xì)胞復(fù)制所需的核苷酸，可增強(qiáng)代謝酶活性，促進(jìn)動(dòng)物生長、提高飼料利用率等[21]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼料中添加4 g/kg 的核苷酸，對(duì)虎龍雜交石斑魚的增重率、特定生長率、飼料系數(shù)無顯著性影響。與對(duì)照組相比，質(zhì)量增重率、特定生長率分別增加7.24%和4.06%，且存活率顯著增加。韓春梅等[8]和Lin 等[22]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加一定量的核苷酸能顯著促進(jìn)奧尼羅非魚幼魚和點(diǎn)帶石斑魚Epinephelus malabaricus 的生長，但是各種試驗(yàn)結(jié)果也不盡一致。Safar 等[23]發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加核苷酸對(duì)細(xì)長爪鰲蝦Astacus leptodctylus 的促生長作用不明顯。在本試驗(yàn)中，添加外源核苷酸沒有顯著促進(jìn)虎龍雜交石斑魚的增重率和特定生長率，但較對(duì)照組略有增加。成活率的顯著性增加，說明一定量的核苷酸能有效增強(qiáng)虎龍雜交石斑魚的免疫力。據(jù)推測(cè)，核苷酸在水產(chǎn)動(dòng)物中促生長效果可能存在種系的差異。有關(guān)外源核苷酸對(duì)石斑魚的生長性能研究報(bào)道較少，其作用機(jī)理尚不清楚，有待更深入的研究。

3.2.2 免疫能力

向梟等[24]研究發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加519.85～774.00 mg/kg 核苷酸能提高鯉血清溶菌酶活性；曹俊明等[25]研究表明，飼料中添加0.8 g/kg 外源核苷酸可顯著提高凡納濱對(duì)蝦Litopenaeus vannamei 血清中溶菌酶活性，增強(qiáng)非特異性免疫功能以及抵抗病原微生物感染的能力。本研究表明，飼料中添加4 g/kg 核苷酸對(duì)虎龍雜交石斑魚血清溶菌酶活性雖無顯著影響，但與對(duì)照組相比增加了38.38%。這是否與試驗(yàn)魚種、飼料組成、試驗(yàn)條件、核苷酸的劑量及劑型不同有關(guān)，還需要進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，投喂核苷酸能誘導(dǎo)IL-1β、IFN-γ 和HSP70 三種免疫相關(guān)基因在虎龍雜交石斑魚腎臟、脾臟組織中的合成與分泌，這與Reda 等[26]的研究結(jié)果相一致。目前，關(guān)于外源核苷酸影響機(jī)體非特異性免疫功能的機(jī)理還不清楚，究其原因可能是參加免疫的大部分細(xì)胞合成的核苷酸不能滿足所需，影響了吞噬細(xì)胞和白細(xì)胞等的增殖、分化和活力以及紅細(xì)胞的數(shù)目。

3.3 結(jié)論

基礎(chǔ)飼料中添加復(fù)方中草藥或核苷酸可維持虎龍雜交石斑魚的正常生長，顯著提高其成活率（P＜0.05）；其中4g/kg 中草藥飼料系數(shù)顯著低于2g/kg 中草藥組（P＜0.05）；4g/kg 中草藥、4g/kg 核苷酸能顯著增加魚體肥滿度和臟體比（P＜0.05）；4g/kg 復(fù)方中草藥、2g/kg 中草藥或4g/kg 核苷酸能增強(qiáng)虎龍雜交石斑魚腎臟、脾臟中IL-1β、IFN-γ、HSP70 免疫相關(guān)基因的表達(dá)，其中，2g/kg 中草藥添加劑的增強(qiáng)效果更明顯。綜上所述，2g/kg、4g/kg 的復(fù)方中草藥添加量能有效促進(jìn)虎龍雜交石斑魚生長，具有一定的增強(qiáng)免疫效果。