任海，張諾，華智杰，梅靜，梁俊平，李雪冬

（1.河北科技師范學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，河北 昌黎 066600；2.河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007；3.秦皇島市國(guó)家級(jí)水產(chǎn)種質(zhì)資源保護(hù)區(qū)管理處，河北 秦皇島 066000）

甲醛（HCHO）是一種具有強(qiáng)烈刺激性氣味的氣體，易溶入水，通常將40%的甲醛水溶液稱(chēng)為福爾馬林。甲醛能與機(jī)體內(nèi)的蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，還能與細(xì)胞質(zhì)結(jié)合而殺滅細(xì)菌、寄生蟲(chóng)、真菌、芽孢和病毒等，是水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用的化學(xué)藥物[1]，尤其是寄生蟲(chóng)疾病的防治中。甲醛毒性強(qiáng)，副作用較大，對(duì)魚(yú)類(lèi)有明顯的負(fù)面影響，表現(xiàn)為：不安亂竄，浮頭，鰓損傷，身體側(cè)翻失去平衡，甚至死亡[2]。

甲醛治療魚(yú)類(lèi)寄生蟲(chóng)病時(shí)，對(duì)機(jī)體抗氧化系統(tǒng)機(jī)能的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。魚(yú)類(lèi)具有完善的抗氧化系統(tǒng)，用于抵御外界氧化脅迫因子產(chǎn)生的活性氧自由基[3]。當(dāng)體內(nèi)活性氧自由基量增加時(shí)，機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)相應(yīng)抗氧化酶的活性受到影響[4]。抗氧化酶活力的變化在一定程度上能反映魚(yú)類(lèi)在不同環(huán)境條件下的生理狀況，可作為衡量魚(yú)類(lèi)是否受到外界環(huán)境脅迫的重要生理指標(biāo)，如超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽（GSH）等抗氧化酶類(lèi)在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的作用[5-7]，而丙二醛（MDA）作為機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化作用的終產(chǎn)物，其含量高低可間接反映機(jī)體的脂質(zhì)過(guò)氧化水平以及生物細(xì)胞受活性氧自由基攻擊的程度[8]。本研究通過(guò)測(cè)定用不同濃度甲醛處理后鯽Carassius auratus 血清中SOD、CAT、GSH 活力和MDA 含量變化，以探討鯽抗氧化系統(tǒng)對(duì)甲醛脅迫后的響應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用鯽購(gòu)自昌黎縣碣陽(yáng)湖，平均體質(zhì)量為（500±25）g，暫養(yǎng)一周后，選規(guī)格相近、無(wú)病無(wú)傷的健康個(gè)體進(jìn)行試驗(yàn)。

主要儀器：水族箱（70cm×20cm×30cm）、電子天平、臺(tái)式高速離心機(jī)、恒溫水浴鍋、酶標(biāo)儀等。

主要試劑：甲醛（分析純，含量為40.0%）購(gòu)自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、過(guò)氧化氫酶（CAT）活性和丙二醛（MDA）含量的試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

試驗(yàn)用水為充分曝氣的自來(lái)水，pH 為（7.0±0.2），溫度為（20±2）℃。鯽隨機(jī)分為對(duì)照組（不添加甲醛）和試驗(yàn)組，每組設(shè)3 個(gè)平行，每個(gè)平行4 尾。將甲醛溶液于1 000mL 燒杯中稀釋后潑灑到水族箱內(nèi)，使箱內(nèi)水體中甲醛終濃度為50mg/L 和100mg/L。試驗(yàn)期間持續(xù)充氧，觀察鯽的活力。潑灑甲醛后1h、3h 和6h 隨機(jī)從每個(gè)魚(yú)缸內(nèi)撈取1 尾魚(yú)，尾靜脈采血，合并3 尾魚(yú)血液于1.5mL 離心管中，4℃冰箱放置6h 后3 000r/min（4℃）離心10min，收集血清，保存在-20℃冰箱中備用。

CAT、SOD 和GSH 活性及MDA 含量按照南京建成生物工程研究所試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。每min 分解1μmol 的過(guò)氧化氫即為1 個(gè)酶活力單位（U）。每mg 組織蛋白在1mL 反應(yīng)液中SOD 抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD 量為1 個(gè)SOD 活力單位（U）；用5，5'-二硫代硝基苯甲酸（DTNB）比色法測(cè)定GSH 活性；采用TBA 法測(cè)定MDA 含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有指標(biāo)測(cè)定均重復(fù)3 次，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2003 處理后，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，利用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA），經(jīng)Duncan's 檢驗(yàn)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 甲醛對(duì)鯽血清SOD 活力的影響

由圖1 可知，不同甲醛濃度（50mg/L 和100mg/L）浸泡鯽1～6h，隨著甲醛脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，試驗(yàn)組鯽血清中SOD 活力先升高后降低，在3h 達(dá)最大值，之后有所下降，但是，在整個(gè)過(guò)程中SOD 活力均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

圖1 甲醛對(duì)鯽血清SOD 活力的影響Fig.1 Effect of formaldehyde exposure on SOD activity in serum of crucian carp

2.2 甲醛對(duì)鯽血清CAT 活力的影響

由圖2 可知，隨著甲醛脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，試驗(yàn)組鯽血清中CAT 活力先升高后下降，3h 達(dá)最大值。50mg/L 甲醛處理組1h 血清中CAT 活力顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）；而50mg/L 和100mg/L 甲醛處理組3h和6h 血清中CAT 活力均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

2.3 甲醛對(duì)鯽血清GSH 活性的影響

圖2 甲醛對(duì)鯽血清CAT 活力的影響Fig.2 Effect of formaldehyde exposure on CAT activity in serum of crucian carp

圖3 甲醛處理對(duì)鯽血清GSH 活力的影響Fig.3 Effects of formaldehyde exposure on GSH activity in serum of crucian carp

由圖3 可知，不同濃度甲醛浸泡6h 后，隨著甲醛處理時(shí)間的延長(zhǎng)，鯽血清中GSH 活力先升高后降低，3h 時(shí)達(dá)最高值。50mg/L 和100mg/L 甲醛處理1h和6h 后，鯽血清中GSH 活力與對(duì)照組無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；而不同濃度甲醛處理組3h 血清中GSH活力均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

2.4 甲醛對(duì)鯽血清MDA 含量的影響

由圖4 可知，不同濃度甲醛浸泡6h 后，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，鯽血清中MDA 含量大致呈現(xiàn)先降低后升高的變化趨勢(shì)，6h 達(dá)到最高值。1h 時(shí)50mg/L 甲醛處理組鯽血清中MDA 含量與對(duì)照組無(wú)顯著性差異（P＞0.05），但是100mg/L 甲醛處理組MDA 含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。3h 時(shí)50mg/L 甲醛組MDA含量顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），而100mg/L 甲醛組與對(duì)照組無(wú)顯著性差異（P＞0.05），但是，50mg/L 和100mg/L 甲醛處理組在6h 均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

圖4 甲醛處理對(duì)鯽血清MDA 含量的影響Fig.4 Effect of formaldehyde treatment on MDA content in serum of crucian carp

3 討論

甲醛能與蛋白質(zhì)中氨基酸結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，起到殺滅各種生物的作用，已廣泛用于水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病防治中[9]。有研究認(rèn)為，當(dāng)機(jī)體受到外源性化學(xué)物質(zhì)刺激時(shí)，會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)多的活性氧自由基（ROS），而ROS 能夠引起機(jī)體產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，進(jìn)而發(fā)生細(xì)胞突變、DNA 損傷，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)引起死亡。當(dāng)機(jī)體發(fā)生損傷時(shí)，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生一系列抗氧化酶如SOD、CAT、GSH-Px和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（Glutathionetransferase，GST）等來(lái)防止過(guò)氧化損傷的發(fā)生[10,11]。體內(nèi)酶性抗氧化系統(tǒng)和非酶性抗氧化系統(tǒng)構(gòu)成機(jī)體的抗氧化防御系統(tǒng)[12]。酶性抗氧化酶能夠防止氧化代謝物對(duì)機(jī)體的損傷，這些酶除了可以相互保護(hù)，還能共同抵御外界脅迫因子產(chǎn)生的ROS 對(duì)機(jī)體的損傷[13]。當(dāng)機(jī)體接觸到有害物質(zhì)時(shí)，隨著接觸時(shí)間的延長(zhǎng)或者毒性增強(qiáng)，其抗氧化系統(tǒng)遭到破壞，部分抗氧化物質(zhì)含量和酶活性降低，機(jī)體無(wú)法清除體內(nèi)過(guò)量的自由基，導(dǎo)致機(jī)體氧化損傷，最終表現(xiàn)為脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA 含量增加[14]。本試驗(yàn)用不同濃度甲醛藥浴鯽后，測(cè)定血清中SOD、CAT、GSH 活性和MDA 含量，旨在明確甲醛在治療疾病的同時(shí)對(duì)魚(yú)體抗氧化系統(tǒng)的影響作用。

魚(yú)類(lèi)的非特異性免疫在應(yīng)對(duì)逆環(huán)境應(yīng)激中起主導(dǎo)作用，SOD、CAT 以及GPx 等抗氧化酶對(duì)清除機(jī)體氧化脅迫中產(chǎn)生的活性氧自由基起決定作用[15]，其中SOD 和CAT 的作用基本一致，共同清除體內(nèi)過(guò)多的活性氧自由基，減少機(jī)體氧化損傷，是機(jī)體內(nèi)重要的保護(hù)酶。SOD 是機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)的第一道防線，當(dāng)體內(nèi)活性氧增多時(shí)，SOD 首先發(fā)揮清除活性氧的功能，隨后CAT 發(fā)揮作用，降低活性氧含量，保護(hù)機(jī)體免受損傷。本試驗(yàn)結(jié)果表明，血清中SOD和CAT 的變化趨勢(shì)基本一致，均為先升高后降低的趨勢(shì)。任海等[14]認(rèn)為，上述變化趨勢(shì)可能與SOD 和CAT 行使的功能有關(guān)。本試驗(yàn)中，上述兩種酶在3～6h 均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），其原因可能與體內(nèi)過(guò)氧化損傷發(fā)生應(yīng)激性增高有關(guān)。甲醛持續(xù)作用誘導(dǎo)鯽體內(nèi)ROS 增加，機(jī)體反饋性增強(qiáng)抗氧化系統(tǒng)酶活力來(lái)對(duì)抗甲醛氧化損傷產(chǎn)生的過(guò)多ROS，這可能與毒物興奮作用有關(guān)[16]。強(qiáng)俊等[17]在研究氨氮與擁擠脅迫對(duì)吉富品系尼羅羅非魚(yú)Oreochromis niloticus幼魚(yú)肝臟抗氧化指標(biāo)的影響中也發(fā)現(xiàn)，機(jī)體通過(guò)增加代謝來(lái)應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫，氧自由基也隨之增加，SOD與CAT 活力的增加被認(rèn)為是生物體對(duì)新陳代謝的適應(yīng)，能夠減輕脂質(zhì)過(guò)氧化物損傷。

GSH 作為谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的底物，是組織中主要的非蛋白質(zhì)疏基化合物，可以使細(xì)胞含疏基的酶和蛋白質(zhì)免受氧化損傷，在細(xì)胞抗ROS 損傷的解毒代謝中起著重要作用，在消除細(xì)胞中H2O2方面具有與CAT 相似的功能[18]。研究發(fā)現(xiàn)GSH 是機(jī)體抵御氧化損傷重要的酶，能夠調(diào)節(jié)生物體內(nèi)自由基濃度的平衡，保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整，是衡量機(jī)體抗氧化能力大小的重要因素。本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著甲醛脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，GSH 活性呈現(xiàn)先升高后下降的變化趨勢(shì)，不同濃度甲醛處理組均在3h 出現(xiàn)峰值，且低濃度甲醛組GSH 活性高于高濃度組，推測(cè)這種現(xiàn)象可能是由于低毒脅迫的誘導(dǎo)作用。王小嬌等[19]研究表明：尼羅羅非魚(yú)暴露在低濃度Cd 時(shí)，受Cd 脅迫而產(chǎn)生大量活性氧，應(yīng)急系統(tǒng)被激活，GSH 含量隨Cd 質(zhì)量濃度的增大而升高。

MDA 是一種高活性脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，可以衡量脂質(zhì)過(guò)氧化程度，間接反映動(dòng)物機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的的損傷程度，判定動(dòng)物體的健康情況[20]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，鯽血清中MDA 含量隨著甲醛脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而先降低后升高，3h 最低，6h 達(dá)最大值。其原因可能是甲醛脅迫使得組織中產(chǎn)生過(guò)多的活性氧，一方面機(jī)體通過(guò)提高自身的抗氧化酶活力如SOD、CAT 和GSH 等抗氧化酶來(lái)消除自由基，減弱脂質(zhì)過(guò)氧化作用，最終表現(xiàn)為MDA 含量較低[21]；另一方面隨著甲醛濃度增加和脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，在一定程度上超過(guò)了機(jī)體所承受的范圍時(shí)，機(jī)體產(chǎn)生過(guò)量的活性氧對(duì)機(jī)體造成氧化損傷，破壞了細(xì)胞電子傳遞鏈、線粒體膜電位及ATP 能量產(chǎn)生，嚴(yán)重時(shí)引起機(jī)體細(xì)胞凋亡或壞死[22,23]。這也進(jìn)一步提示，甲醛脅迫下MDA積累可能是甲醛對(duì)鯽產(chǎn)生毒害作用的主要原因之一。本研究中甲醛脅迫能否導(dǎo)致鯽細(xì)胞凋亡，需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。