卞紫秀,馬 輝，汪建飛,陳雪怡，胡舒敏,王順民

(安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000)

苦蕎麥?zhǔn)且环N藥食兩用植物，含有多種營養(yǎng)成分，包括碳水化合物、蛋白質(zhì)、多酚、植物甾醇、維生素、類胡蘿卜素和礦物質(zhì)[1]，尤其是其富含蘆丁等黃酮類物質(zhì)[2]?？嗍w黃酮等獨(dú)特的營養(yǎng)成分使其具有抗氧化、抗癌、降膽固醇、降血糖和降血脂等醫(yī)療保健作用[3]。大量的研究表明，苦蕎麥種子萌發(fā)后其營養(yǎng)價(jià)值大幅度地提高[4]，特別是黃酮類物質(zhì)的含量增加顯著[5]，抗氧化活性顯著提高[6-7]。超聲波作為一種無公害的物理處理手段在生物科學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用。研究表明，超聲波可有效刺激種子中細(xì)胞組織[8]，提高種子中相關(guān)酶的酶活[8]以及種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢[9-10]，可以促進(jìn)種子富集生物活性成分[6]。張冬晨[6]等證實(shí)，蕎麥種子采用480 W超聲波處理20 min后，其發(fā)芽率可以提高至94%，總黃酮含量達(dá)156.70 mg蘆丁/g。而王順民[1]等研究發(fā)現(xiàn)，苦蕎麥種子采用超聲波功率280 W、溫度30 ℃、時(shí)間30 min處理，其芽苗(6 d)中總黃酮的含量達(dá)9.46 g/100 g。土壤鹽漬化是全世界正面臨的資源和生態(tài)問題，而種植耐鹽堿植物是改良土壤鹽漬化的最有效措施。苦蕎麥?zhǔn)堑湫偷柠}堿地作物[11]，而研究證實(shí)低摩爾濃度的NaCl脅迫也可以促進(jìn)作物種子萌發(fā)，并影響谷物中活性成分的含量[12-13]。亦有研究表明在NaCl脅迫下，超聲波處理可提高水稻種子的發(fā)芽率，增強(qiáng)種子內(nèi)α-淀粉酶、SOD和POD的活性[14]。李敏[15]等研究證實(shí)，超聲波分別聯(lián)合CaCl2和KNO3處理均對在NaCl脅迫和干旱脅迫下的谷物種子萌發(fā)和幼苗生長具有促進(jìn)作用，提高了谷子的抗鹽耐旱性。但對NaCl脅迫下超聲波處理對苦蕎麥種子萌發(fā)及成分變化的影響的研究尚無。因此，采用超聲波協(xié)同NaCl脅迫的方法處理苦蕎麥，探究超聲波處理對NaCl脅迫下苦蕎麥種子萌發(fā)及萌發(fā)后芽苗中總黃酮、還原糖和丙二醛等成分含量及抗氧化性能的影響，以期為苦蕎麥的種植開發(fā)提供一定理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苦蕎麥(FagopyrumTataricumGaertn)，含水量14%(寧夏鹽池種子公司)；蘆丁、DPPH、3，5-二硝基水楊酸等試劑AR(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；氯化鈉AR(上海山浦化工有限公司)。

電子天平JY1002(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)TGL-16A(長沙平凡儀器儀表有限公司)；可見分光光度計(jì)L3S(上海儀電分析儀器有限公司)；光照種子發(fā)芽箱YRG-150(上海臺(tái)恒儀器設(shè)備有限公司)；高功率數(shù)控超聲波清洗器JK-400CDB(合肥金尼克機(jī)械制造有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

原料預(yù)處理：選擇適量顆粒飽滿、大小均一的苦蕎麥種子，以1 g/L的高錳酸鉀溶液浸泡消毒5 min，用自來水洗滌至水澄清。然后置于25 ℃的水中浸泡4 h，期間換水一次。再將種子置于50 ℃熱水中催芽處理15 min。脅迫方法：將預(yù)處理過的苦蕎麥種子(約150粒)置于150 mL燒杯中，加入蒸餾水至浸沒種子。燒杯置于超聲波器(頻率40 kHZ)中，水溫控制在29±0.5 ℃，在一定功率下處理一定時(shí)間。將經(jīng)過超聲波處理后的種子轉(zhuǎn)移至鋪有10 cm直徑、內(nèi)襯雙層濾紙的培養(yǎng)皿中(50粒種子/皿)。培養(yǎng)皿移入培養(yǎng)箱中，在溫度為25 ℃、相對濕度為75±5%環(huán)境下避光培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)過程中每隔24 h用一定摩爾濃度NaCl溶液噴淋一次，測定發(fā)芽率。

對照實(shí)驗(yàn)(CK)：取預(yù)處理過的苦蕎麥種子(不做超聲波處理)均勻平鋪于培養(yǎng)皿，后置于培養(yǎng)箱進(jìn)行萌發(fā)培養(yǎng)，期間每隔24 h用蒸餾水噴淋進(jìn)行培養(yǎng)。

(1)單因素試驗(yàn)。

①NaCl摩爾濃度對種子發(fā)芽率的影響。將預(yù)處理過的苦蕎麥種子置于超聲波器中，在水溫29±0.5 ℃下，以280 W功率超聲波處理30 min，后移入培養(yǎng)箱中，在溫度為25 ℃、相對濕度為75±5%的環(huán)境下避光培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)過程中每隔24 h，分別用0、2.5 mmol/L、5 mmol/L、7.5 mmol/L、10 mmol/L、15 mmol/L和20 mmol/L NaCl溶液噴淋一次，每次8 mL，測定發(fā)芽率，同時(shí)做對照試驗(yàn)。

②超聲波功率對種子發(fā)芽率的影響。將經(jīng)預(yù)處理過的種子，分別以0、200 W、240 W、280 W、320 W、360 W和400 W功率超聲波處理30 min，后移入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(其他步驟及條件同1.3(1))。培養(yǎng)過程中每隔24 h以5 mmol/L NaCl溶液噴淋一次，測定發(fā)芽率。

③超聲波處理時(shí)間對苦蕎麥種子發(fā)芽率的影響。將預(yù)處理過的種子，以280 W功率超聲波分別超聲處理0、10 min、20 min、30 min和40 min，后移入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)和NaCl脅迫萌發(fā)(條件同1.3(2))，測定發(fā)芽率。

(2)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以NaCl摩爾濃度、超聲波功率、超聲波處理時(shí)間為自變量，以發(fā)芽率為響應(yīng)值，根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)(CCD)實(shí)驗(yàn)，設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，其因素水平表如表1所示。并對優(yōu)化出的最佳條件進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)。

表1 響應(yīng)面分析因素水平表

1.3 指標(biāo)測定

測定不同條件處理后(含最優(yōu)條件)萌發(fā)3 d、5 d、7 d的苦蕎麥芽苗中的總黃酮、還原糖和丙二醛的含量及芽苗對DPPH自由基的清除率，以比較最優(yōu)發(fā)芽處理及其他不同處理對主要成分含量的影響。

(1)發(fā)芽率。自開始培養(yǎng)起，每隔12 h測量其發(fā)芽率，測定3 d、5 d、7 d的發(fā)芽率(胚軸突破種皮1 mm即為萌發(fā))，每組重復(fù)3次[11]。按式(1)計(jì)算發(fā)芽率：

(1)

(2)總黃酮含量測定。取一定量的苦蕎麥芽苗置于研缽中，加入適量的60%乙醇溶液進(jìn)行研磨，提取30 min，將提取液置于轉(zhuǎn)速為9 000 r/min的離心機(jī)中離心15 min，以離心后的上清液為樣液，利用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法[12]進(jìn)行黃酮含量的測定(g/100 g鮮重計(jì)，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品)。

(3)DPPH自由基清除能力。準(zhǔn)確稱取0.3 g苦蕎麥芽苗，置于研缽中，加入少量的60%乙醇溶液，進(jìn)行充分研磨，提取30 min，后用60%乙醇定容至10 mL,作為樣品溶液。吸取樣液0.2 mL于試管中，加入質(zhì)量體積濃度為0.002 5 mg/mL DPPH乙醇溶液7.8 mL，立即搖勻，放置于避光處30 min，用無水乙醇和相應(yīng)質(zhì)量體積濃度的樣品溶液作參比，于517 nm處測其吸光值。苦蕎麥芽中的黃酮類化合物對DPPH自由基的清除率按式(2)計(jì)算：

I=1-(Ai-Aj)/A0×100%,

(2)

式中，I為DPPH·自由基清除率；A0為原始溶液的吸光值；Aj為參比溶液的吸光值；Ai為待測溶液的吸光值。

(4)丙二醛含量。稱取0.3 g苦蕎芽苗，加入2 mL 10% TCA和少量石英砂，在研缽中充分研磨成勻漿，再加8 mL TCA進(jìn)一步研磨，勻漿離心(4 000 r/min) 10 min，吸取離心的上清液2 mL(對照組加2 mL蒸餾水)，加入2 mL 0.6% TBA，混勻物于沸水浴上反應(yīng)15 min，迅速冷卻后再離心。取上清液測定532 nm、600 nm和450 nm波長下的吸光度?？嗍w麥芽中的丙二醛含量按式(3)計(jì)算：

(3)

(5)還原糖含量的測定。準(zhǔn)確稱量樣品0.3 g，研磨后放入100 mL燒杯中，加入50 mL蒸餾水，將其攪拌搖勻，置于50 ℃恒溫水浴鍋中保溫20 min，使其還原糖得以溶出。將處理的樣品進(jìn)行離心過濾，用20 mL蒸餾水洗殘?jiān)?，再離心或過濾。將兩次離心液轉(zhuǎn)移至100 mL的容量瓶中，用蒸餾水進(jìn)行定容，混勻，作為還原糖待測液。再利用3，5-二硝基水楊酸法進(jìn)行測定[13]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)為3次重復(fù)，計(jì)算平均值(M)和標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)，結(jié)果用M±SD形式表示，采用Excel和SigmaPlot 10.0等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

(1)NaCl摩爾濃度對苦蕎麥種子萌發(fā)的影響。

圖1 不同NaCl摩爾濃度對發(fā)芽率的影響

①不同NaCl摩爾濃度對發(fā)芽率的影響如圖1所示。由圖1可知，發(fā)芽率隨NaCl摩爾濃度的增加先上升后下降。摩爾濃度為2.5 mmol/L、5 mmol/L、7.5 mmol/L和10.0 mmol/L的NaCl溶液培養(yǎng)苦蕎麥，培養(yǎng)至7 d時(shí)，其發(fā)芽率分別為72.67%、73.33%、72.00%和69.33%，比對照(0 mmol/L)分別增加4.00%、4.67%、3.33%和0.67%。當(dāng)摩爾濃度低于10.0 mmol/L的NaCl脅迫處理后，苦蕎麥發(fā)芽率高于對照組，說明一定范圍內(nèi)的NaCl摩爾濃度對苦蕎麥萌發(fā)有促進(jìn)作用，但促進(jìn)作用有限；當(dāng)NaCl摩爾濃度高于10.0 mmol/L時(shí)，則相反。即NaCl溶液的摩爾濃度為2.5～7.5 mmol/L時(shí)，NaCl脅迫促進(jìn)種子的萌發(fā)效果較好。

②在不同超聲波功率處理下，不同NaCl摩爾濃度對發(fā)芽率的影響如圖2所示。由圖2a可知，當(dāng)超聲功率為200 W，隨NaCl摩爾濃度的增加，苦蕎麥的發(fā)芽率先上升后下降。摩爾濃度為2.5～7.5 mmol/L的NaCl溶液培養(yǎng)苦蕎麥至7 d時(shí)，發(fā)芽率高于對照組(0 mmol/L)，但摩爾濃度高于7.5 mmol/L時(shí)抑制萌發(fā)。其中，5 mmol/L的NaCl溶液處理7 d的苦蕎麥的發(fā)芽率最高，平均發(fā)芽率為73.33%，比對照(0 mmol/L)增加2.67%。由圖2b可知，當(dāng)超聲功率為240 W，苦蕎麥的發(fā)芽率隨NaCl摩爾濃度的增加先上升后下降。摩爾濃度低于10.0 mmol/L時(shí)促進(jìn)種子萌發(fā)，高于10.0 mmol/L則相反。NaCl溶液摩爾濃度為2.5～7.5 mmol/L時(shí)，促進(jìn)苦蕎麥萌發(fā)效果較好，均比對照(0 mmol/L)增加。其中，5 mmol/L的NaCl溶液培養(yǎng)至7 d，苦蕎麥發(fā)芽率最高，為73.33%。即此范圍內(nèi)經(jīng)NaCl脅迫處理的苦蕎麥發(fā)芽率高于未經(jīng)NaCl脅迫處理的。由圖2c可知，當(dāng)超聲功率為280 W，苦蕎麥的發(fā)芽率隨時(shí)間的增加而上升，而隨NaCl摩爾濃度的增加先上升后下降。NaCl溶液摩爾濃度為2.5～7.5 mmol/L時(shí)促進(jìn)種子萌發(fā)效果較好，而高于7.5 mmol/L時(shí)抑制萌發(fā)。其中摩爾濃度為5.0 mmol/L的NaCl培養(yǎng)的發(fā)芽率最高，為81.33%，比對照(0 mmol/L)增加6.67%。由圖2d可知，當(dāng)超聲功率為320 W，隨NaCl摩爾濃度的增加，苦蕎麥的發(fā)芽率先上升后下降。摩爾濃度為2.5～7.5 mmol/L的NaCl溶液培養(yǎng)至7 d時(shí)，發(fā)芽率高于對照組(0 mmol/L)。其中，摩爾濃度為2.5 mmol/L的NaCl溶液培養(yǎng)的苦蕎麥種子發(fā)芽率為77.33%，比對照增加5.33%，此條件培養(yǎng)下苦蕎麥的發(fā)芽率最高。由圖2e可知，當(dāng)超聲功率為360 W，苦蕎麥的發(fā)芽率隨NaCl摩爾濃度的增加先上升后下降。NaCl溶液摩爾濃度低于7.5 mmol/L時(shí)促進(jìn)苦蕎麥種子的萌發(fā)，高于7.5 mmol/L時(shí)則相反。摩爾濃度分別為2.5 mmol/L、5 mmol/L和7.5 mmol/L的NaCl溶液培養(yǎng)苦蕎麥至7 d時(shí)，發(fā)芽率比對照(0 mmol/L)分別增加4.00%、2.00%和2.67%。由圖2f可知，當(dāng)超聲功率為400 W，摩爾濃度為2.5～7.5 mmol/L的NaCl溶液培養(yǎng)至7 d時(shí)，發(fā)芽率比對照(0 mmol/L)分別增加1.33%、3.33%和1.33%，其中，NaCl溶液的摩爾濃度為5 mmol/L時(shí)的發(fā)芽率最高，為73.33%。在不同功率處理下，隨時(shí)間的增加，苦蕎麥的發(fā)芽率呈上升趨勢。隨NaCl摩爾濃度的增加，苦蕎麥的發(fā)芽率先上升后下降，說明在一定范圍內(nèi)的低鹽濃度對苦蕎麥萌發(fā)有促進(jìn)作用；超過一定范圍內(nèi)的高鹽濃度對苦蕎麥萌發(fā)有抑制作用。原因?yàn)殁c離子與種子萌發(fā)所需要的酶發(fā)生反應(yīng)或與酶特異結(jié)合，產(chǎn)生刺激物質(zhì)或使酶活性降低而抑制苦蕎的萌發(fā)[16]。在不同超聲波處理?xiàng)l件下用不同NaCl摩爾濃度進(jìn)行萌發(fā)培養(yǎng)時(shí)，NaCl溶液摩爾濃度為2.5～7.5 mmol/L時(shí)NaCl脅迫促進(jìn)種子萌發(fā)效果較好。

圖2 不同超聲功率處理及不同NaCl摩爾濃度對發(fā)芽率的影響(超聲時(shí)間30 min)

(2)在相同NaCl摩爾濃度下，不同超聲波功率對發(fā)芽率的影響如圖3所示。由圖3a可知，蒸餾水培養(yǎng)至7 d時(shí)，隨超聲波處理功率的增加，苦蕎麥的發(fā)芽率先上升后下降。萌發(fā)培養(yǎng)發(fā)芽至第7 d時(shí)，超聲波功率為200～400 W時(shí)的發(fā)芽率比CK(無超聲波處理、蒸餾水萌發(fā)培養(yǎng))的發(fā)芽率高，即經(jīng)超聲波處理的苦蕎麥種子的發(fā)芽率高于未經(jīng)超聲波處理的，說明超聲波對苦蕎麥萌發(fā)有促進(jìn)作用，且不同超聲波功率的促進(jìn)作用不同。其中，超聲波功率為280～360 W處理時(shí)發(fā)芽率分別為74.67%、76.67%和73.33%，均高于對照，但無顯著差異。由圖3b可知，2.5 mmol/L NaCl溶液處理下，經(jīng)超聲波功率為240～360 W處理的苦蕎麥發(fā)芽率高于未經(jīng)超聲波處理的，即超聲波協(xié)同NaCl脅迫對苦蕎麥萌發(fā)有促進(jìn)作用，超聲波功率為280～360 W處理時(shí)發(fā)芽率均比CK(無超聲波處理、蒸餾水萌發(fā)培養(yǎng))的發(fā)芽率高。其中，超聲波功率280 W處理下的發(fā)芽率最高，為78.00%。而功率為200 W和400 W處理則抑制苦蕎麥發(fā)芽。由圖3c可知，5.0 mmol/L NaCl溶液處理，培養(yǎng)至7 d時(shí)，超聲波功率為240 W、280 W、320 W和360 W時(shí)的發(fā)芽率分別為76.67%、81.33%、74.67%和75.33%，均高于CK(無超聲波處理、蒸餾水萌發(fā)培養(yǎng))，說明超聲波功率240～360 W的超聲波協(xié)同NaCl脅迫對苦蕎麥萌發(fā)有促進(jìn)作用。由圖3d可知，7.5 mmol/L NaCl溶液處理，培養(yǎng)至7 d時(shí)，功率為240～360 W處理的苦蕎麥發(fā)芽率高于未經(jīng)超聲波處理的，說明超聲波協(xié)同NaCl脅迫對苦蕎麥萌發(fā)有促進(jìn)作用；其中功率為360 W時(shí)的發(fā)芽率最高，為76.00%。而經(jīng)超聲波功率為200 W和400 W處理的則相反。不同NaCl摩爾濃度培養(yǎng)條件下用不同超聲波功率處理時(shí)，超聲波功率為280～360 W時(shí)促進(jìn)種子萌發(fā)效果較好。

圖3 相同NaCl摩爾濃度下不同超聲波功率對發(fā)芽率的影響(30 min)

(3)超聲波時(shí)間對苦蕎麥種子萌發(fā)的影響。5.0 mmol/L NaCl、超聲波功率280 W下不同超聲波時(shí)間對發(fā)芽率的影響如圖4所示。由圖4可知，隨超聲波處理時(shí)間的增加，苦蕎麥的發(fā)芽率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在超聲波處理功率280 W、5.0 mmol/L NaCl溶液處理下，培養(yǎng)至7 d時(shí)，超聲波處理10～40 min時(shí)，苦蕎發(fā)芽率為74.67%～73.33%，均高于對照(超聲波處理時(shí)間0 min)，但個(gè)別處理差異不顯著。其中超聲時(shí)間為20 min時(shí)發(fā)芽率最高，而時(shí)間為40 min時(shí)的發(fā)芽率與對照相比基本無變化，即選擇超聲波處理時(shí)間為10～30 min處理。

圖4 5.0 mmol/L NaCl、超聲波功率280 W下不同超聲波時(shí)間對發(fā)芽率的影響

2.2 優(yōu)化超聲波及NaCl脅迫處理?xiàng)l件的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

(1)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果。采用Design Expert 8.05軟件對響應(yīng)值(發(fā)芽率)與各因素(超聲波處理時(shí)間、超聲波處理功率、NaCl溶液摩爾濃度)進(jìn)行回歸擬合后，得到回歸方程：

Y(發(fā)芽率)=-404.67+1.435A+2.83B+94.07C-0.001AB+0.4AC-0.38BC-0.03A2-

0.004B2+9.6C2

式中，A為超聲波處理時(shí)間；B為超聲波處理功率；C為NaCl溶液摩爾濃度。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

(2)響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析。由表3可知該模型P值為0.021 1(P<0.05)，表明該回歸模型擬合顯著，各因素對指標(biāo)影響的順序?yàn)镃、A、B，其中C因素(NaCl溶液摩爾濃度)和交互項(xiàng)BC(超聲功率/NaCl溶液摩爾濃度)影響顯著(P<0.05)，而B2極顯著。相關(guān)系數(shù)R2為0.868，但失擬項(xiàng)不顯著，說明該模型與實(shí)際情況接近，能充分反映出各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，可以用于苦蕎麥萌發(fā)工藝的預(yù)測。

(3)優(yōu)化超聲波及NaCl脅迫處理?xiàng)l件的響應(yīng)面圖分析。根據(jù)響應(yīng)方程繪制響應(yīng)面曲面圖和等高線圖，響應(yīng)面圖形能直觀地反映各因素和它們之間的交互作用對響應(yīng)值的影響[14-15]。超聲功率和超聲時(shí)間交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖如圖5所示。從圖5可知，隨著超聲功率由280 W增加至360 W，超聲時(shí)間由10 min增加至30 min時(shí)，發(fā)芽率先增加后降低，分別在功率360 W和時(shí)間20 min時(shí)達(dá)到最大值，且二者交互影響顯著。

NaCl溶液摩爾濃度和超聲時(shí)間交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖如圖6所示。從圖6可知，隨著超聲時(shí)間由10 min增加至30 min時(shí)，發(fā)芽率先增加后降低，超聲20 min時(shí)達(dá)到最大值，而當(dāng)超聲時(shí)間一定時(shí)，隨著NaCl由2.5 mmol/L增加至7.5 mmol/L時(shí)，其發(fā)芽率降低。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析

注：*差異顯著，P<0.05；**差異極顯著，P<0.01

圖5 超聲功率和超聲時(shí)間交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖

圖6 NaCl溶液摩爾濃度和超聲時(shí)間交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖

NaCl溶液摩爾濃度和超聲功率交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖如圖7所示。從圖7可知，隨著NaCl由2.5 mmol/L增加至7.5 mmol/L時(shí)，超聲功率為280～320 W時(shí)發(fā)芽率逐漸增加，而當(dāng)功率為320～360 W時(shí)降低，且二者交互影響極顯著。

圖7 NaCl溶液摩爾濃度和超聲功率交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖

根據(jù)Design-Expert軟件分析優(yōu)化得超聲波協(xié)同NaCl脅迫促進(jìn)苦蕎麥種子萌發(fā)的最優(yōu)工藝為：超聲波處理時(shí)間21 min，處理功率327 W，NaCl溶液摩爾濃度3.0 mmol/L。在此條件下，苦蕎麥種子的發(fā)芽率為86%?？紤]到實(shí)際操作的局限性對其修正，修正后的工藝條件為：超聲波時(shí)間21 min，超聲波功率320 W，NaCl溶液摩爾濃度3.0 mmol/L。

2.3 驗(yàn)證及對比試驗(yàn)結(jié)果

(1)超聲波及NaCl脅迫處理對苦蕎麥發(fā)芽率的影響。為了驗(yàn)證響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果，選擇最佳工藝(C1：21 min，320 W+3.0 mmol/L)分別隨機(jī)與較低強(qiáng)度的處理功率(C2：20 min，280 W+7.5 mmol/L；C4：30 min，280 W+5.0 mmol/L)和中等強(qiáng)度的超聲功率(C3：20 min，320 W+5.0 mmol/L，C5：10 min，320 W+7.5 mmol/L)進(jìn)行組合實(shí)驗(yàn)。不同處理?xiàng)l件對苦蕎麥種子發(fā)芽率的影響如圖8所示。由圖8可知，不同超聲波及NaCl脅迫處理對苦蕎麥種子發(fā)芽率的影響差異不顯著。響應(yīng)面優(yōu)化得到的最優(yōu)工藝為超聲波處理時(shí)間21 min、超聲波處理功率320 W、NaCl溶液摩爾濃度3.0 mmol/L，此處理?xiàng)l件下的發(fā)芽率最高，平均發(fā)芽率為87.33%，說明該模型能較好地預(yù)測苦蕎麥種子發(fā)芽率，所得工藝條件可靠。

(2)超聲波及NaCl脅迫處理對苦蕎麥總黃酮含量的影響。不同處理?xiàng)l件對苦蕎芽苗總黃酮含量的影響如圖9所示。由圖9可知，在不同處理?xiàng)l件下，3 d、5 d、7 d苦蕎芽苗的總黃酮含量隨萌發(fā)時(shí)間的增加而提高。超聲波協(xié)同NaCl脅迫處理后萌發(fā)的苦蕎麥芽苗的總黃酮含量均比CK組高，說明超聲波協(xié)同NaCl脅迫處理能促進(jìn)苦蕎麥芽苗中總黃酮的提高。其中，超聲波處理時(shí)間21 min、超聲波功率320 W、NaCl溶液摩爾濃度3.0 mmol/L處理?xiàng)l件下，第7 d的苦蕎芽苗總黃酮含量最高，達(dá)到1.59 g/100 g，是CK總黃酮含量的2.3倍，可能是因?yàn)樵撎幚硖岣吡它S酮合成相關(guān)酶基因的表達(dá)量。以上說明該處理?xiàng)l件可顯著提高苦蕎芽苗中的總黃酮含量。

圖8 不同處理?xiàng)l件對苦蕎麥種子發(fā)芽率的影響 圖9 不同處理?xiàng)l件對苦蕎芽苗總黃酮含量的影響

(3)超聲波及NaCl脅迫處理對苦蕎麥DPPH清除能力的影響。不同處理?xiàng)l件對苦蕎芽苗DPPH清除能力的影響如圖10所示。由圖10可知，在不同處理?xiàng)l件下，3 d、5 d、7 d苦蕎芽苗的DPPH清除能力隨時(shí)間的增加而增加。超聲波協(xié)同NaCl脅迫處理后的苦蕎麥芽苗對DPPH自由基的清除率均顯著高于CK組。其中，超聲波處理時(shí)間21 min、超聲波功率320 W、NaCl溶液摩爾濃度3.0 mmol/L處理?xiàng)l件下，第7 d的苦蕎芽苗的DPPH自由基清除率最高(98.23%)，比對照增加18.18%，原因?yàn)辄S酮有一定的抗氧化作用，黃酮的積累可以抵御脅迫，從而導(dǎo)致芽苗對DPPH自由基的清除率增加。以上說明該處理可提高苦蕎芽苗對DPPH自由基的清除率。

(4)超聲波及NaCl脅迫處理對苦蕎麥還原糖含量的影響。不同處理?xiàng)l件對苦蕎芽苗還原糖含量的影響如圖11所示。由圖11可知，在不同處理?xiàng)l件下，3 d、5 d、7 d苦蕎芽苗的還原糖含量隨時(shí)間的增加而增加。發(fā)芽至第3 d時(shí)，C1、C4和C5處理?xiàng)l件下的苦蕎麥芽苗的還原糖含量高于CK組，而C2和C3組則相反。發(fā)芽至第5 d、7 d時(shí)，不同超聲波協(xié)同NaCl脅迫處理后的苦蕎麥芽苗的還原糖含量均高于CK組。其中，超聲波處理時(shí)間21 min、超聲波功率320 W、NaCl摩爾濃度3.0 mmol/L處理?xiàng)l件下，第7 d的苦蕎芽苗的還原糖含量最高，平均還原糖含量為17.04 g/100 g，比CK組還原糖含量增加了8.66 g/100 g，可能在此脅迫條件下能使淀粉更加快速和完全地轉(zhuǎn)化為還原糖。因此該處理?xiàng)l件可提高苦蕎芽苗中還原糖含量。萌發(fā)過程中，種子中淀粉酶活力不斷增強(qiáng)，且適當(dāng)處理能激活種子的淀粉酶，使還原糖含量增加[16]。另外，在避光條件下無光合作用和呼吸作用，不會(huì)消耗還原糖等物質(zhì)，所以不同超聲波協(xié)同NaCl脅迫處理后的苦蕎麥芽苗的還原糖含量增加。

圖10 不同處理?xiàng)l件對苦蕎芽苗DPPH清除能力的影響 圖11 不同處理?xiàng)l件對苦蕎芽苗還原糖含量的影響

(5)超聲波及NaCl脅迫處理對苦蕎麥丙二醛含量的影響。不同的處理?xiàng)l件對苦蕎芽苗丙二醛含量的影響如圖12所示。由圖12可知，在不同處理?xiàng)l件下，3 d、5 d、7 d苦蕎芽苗的丙二醛含量隨萌發(fā)時(shí)間的增加而增加。丙二醛是膜脂過氧化作用的最終分解產(chǎn)物，其含量可以反映植物遭受逆境傷害的程度。由圖12可知，不同超聲波協(xié)同NaCl脅迫處理后發(fā)芽至第3 d、5 d、7 d的苦蕎麥芽苗的丙二醛含量均高于CK組，說明苦蕎麥芽苗遭受一定的逆境傷害。超聲波處理21 min、超聲波功率320 W、NaCl摩爾濃度3.0 mmol/g處理?xiàng)l件下，第7 d的苦蕎芽苗的丙二醛含量最低，平均丙二醛含量為7.18 nmol/g，說明此條件下的苦蕎麥芽苗遭受逆境傷害的程度最低。

圖12 不同處理?xiàng)l件對苦蕎芽苗丙二醛含量的影響

3 討論

研究中NaCl摩爾濃度為2.5～7.5 mmol/L處理后，種子萌發(fā)的效果優(yōu)于比照，說明低鹽對苦蕎麥萌發(fā)有促進(jìn)作用，但NaCl溶液摩爾濃度高于此范圍則抑制種子萌發(fā)。在5 mmol/L NaCl溶液脅迫下，280 W的超聲波處理30 min，其發(fā)芽率最高為81.33±4.16%，超聲波處理后的種子的發(fā)芽率均比CK高，說明超聲波對苦蕎麥萌發(fā)也有促進(jìn)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與報(bào)道的超聲波波干法處理可提高水稻種子發(fā)芽率的結(jié)果相一致[9]。種子在萌發(fā)之前采用適宜的短時(shí)間的超聲波處理不僅能促進(jìn)萌發(fā)，還能促進(jìn)其抗氧化能力的提高[6]。研究中，在NaCl脅迫下，不同超聲波處理后可以提高萌發(fā)率，但是超聲波處理時(shí)間為10～30 min時(shí)效果較好。李妹娟[14]等研究證實(shí)在0.8% NaCl脅迫下，超聲波處理(220 W，5 min)可增加水稻種子的發(fā)芽率，增強(qiáng)SOD和POD活性而MDA含量降低。李敏[15]研究認(rèn)為，100 W功率超聲波和10 mmol/L CaCl2的聯(lián)合處理，對谷子種子在NaCl脅迫和干旱脅迫環(huán)境中的萌發(fā)和生長具有促進(jìn)作用。由此說明超聲波處理確有緩解NaCl脅迫的作用。

研究中在最優(yōu)條件下，超聲波對苦蕎麥種子的NaCl脅迫效應(yīng)有緩解作用，結(jié)果與單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相一致，而且超聲功率與NaCl溶液摩爾濃度之間有交互影響。在最優(yōu)條件下，苦蕎芽苗中總黃酮含量最高，達(dá)到1.59 g/100 g(鮮重)，是CK總黃酮含量的2.3倍，說明該處理?xiàng)l件可顯著提高苦蕎芽苗中的總黃酮含量。前期研究證實(shí)苦蕎麥種子在超聲波功率280 W、溫度30 ℃、時(shí)間30 min處理?xiàng)l件下，苦蕎麥芽苗(6 d)中總黃酮的含量分別比種子和對照增加2.28和0.697倍[1]。實(shí)驗(yàn)中，在NaCl脅迫下，超聲波處理的苦蕎芽苗對DPPH自由基的清除率比對照增加18.18%，因?yàn)槭w麥種子經(jīng)超聲波處理，其萌發(fā)后芽苗中總黃酮含量顯著增加能提高其抗氧化能力[6]。有報(bào)道證實(shí)0.05%的NaHCO3處理也會(huì)增加類黃酮、總酚類化合物的含量，從而增加DPPH自由基清除能力[12]。

4 結(jié)論

經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化后最優(yōu)工藝為超聲波處理時(shí)間21 min、超聲波功率320 W、NaCl摩爾濃度3.0 mmol/L，此處理?xiàng)l件下的發(fā)芽率最高，平均發(fā)芽率為87.33%。在此條件下芽苗中總黃酮含量和還原糖含量、DPPH清除能力均達(dá)最高，但丙二醛含量為最低。結(jié)果說明，低功率短時(shí)間的超聲波處理和低摩爾濃度的NaCl處理有利于苦蕎種子的萌發(fā)，反之則抑制其萌發(fā)；超聲波協(xié)同NaCl脅迫能有效促進(jìn)種子的萌發(fā)和提高芽苗中總黃酮、還原糖等營養(yǎng)物質(zhì)的含量和對苦蕎麥DPPH的清除能力。