王宇晴 盧玢宇 劉松梅 鄭春英

摘要?[目的]研究?jī)?nèi)生細(xì)菌CX33的活性作用及活性代謝物，探討其與宿主植物刺五加的相關(guān)性。[方法]對(duì)內(nèi)生細(xì)菌CX33進(jìn)行抑菌活性研究;結(jié)合形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性及16S rDNA序列同源性分析對(duì)該菌株進(jìn)行鑒定;采用HPLC法對(duì)CX33發(fā)酵液中活性代謝物進(jìn)行分析。[結(jié)果]內(nèi)生細(xì)菌CX33具有較好的抑菌活性;經(jīng)鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）;經(jīng)檢測(cè)該菌株發(fā)酵液中含有紫丁香苷。[結(jié)論]內(nèi)生細(xì)菌CX33為紫丁香苷產(chǎn)生菌，該菌可能與宿主植物刺五加具有相同的代謝機(jī)制。

關(guān)鍵詞?內(nèi)生細(xì)菌;抑菌活性;鑒定;紫丁香苷

中圖分類號(hào)?R284文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A

文章編號(hào)?0517-6611（2019）22-0184-03

Abstract?[Objective]The research aimed to study the activity and active metabolites of endophytic bacteria CX33， and to explore its correlation with the host plant Acanthopanax senticosus.[Method]The antibacterial activity of endophytic bacteria CX33 was studied. The morphological characteristics， physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence homology analysis were used to identify the strain. The active metabolites in CX33 fermentation broth were analyzed by HPLC.[Result]The endophytic bacteria CX33 had good antibacterial activity; the strain was identified as Bacillus subtilis;the fermentation broth of the strain was tested to contain syringin.[Conclusion]The endophytic bacteria CX33 is a syringinproducing bacterium， which may have the same metabolic mechanism as the host plant Acanthopanax senticosus.

Key words?Endophytic bacteria;Bacteriostatic activities;Identification;Syringin

內(nèi)生菌與宿主植物在長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化過程中形成了互惠共生關(guān)系。宿主植物為內(nèi)生菌生長(zhǎng)發(fā)育提供必須的生態(tài)環(huán)境，避免外界生物或非生物的干擾等[1];同時(shí)，內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物能夠刺激植物生長(zhǎng)發(fā)育，提供宿主植物對(duì)環(huán)境脅迫的抵抗能力[2]，刺激宿主產(chǎn)生各種次生代謝產(chǎn)物以維護(hù)機(jī)體的健康[3]。因此研究?jī)?nèi)生菌活性代謝物對(duì)于表達(dá)其與宿主植物的相關(guān)性具有重要意義[4-5]。

刺五加（Acanthopanax senticosus（Rupr.et Maxim.）Harms）為北方瀕危藥用植物[6]，具有多種活性作用[7]，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于食品、藥品領(lǐng)域。筆者以刺五加內(nèi)生細(xì)菌CX33為研究對(duì)象，對(duì)其開展活性研究;同時(shí)也對(duì)其發(fā)酵液中次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，并對(duì)其進(jìn)行菌種鑒定，為綜合利用該菌株、采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)刺五加活性成分奠定基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?菌種與培養(yǎng)

供試菌：刺五加內(nèi)生細(xì)菌CX33由黑龍江大學(xué)生物制藥專業(yè)實(shí)驗(yàn)分離得到。

NA培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基（見文獻(xiàn)[8]）。

16Sr DNA序列擴(kuò)增引物（上海生工生物工程股份有限公司）。

1.2?儀器與試劑

高效液相色譜儀（型號(hào)：FL2200，產(chǎn)地：浙江溫嶺）。

試劑：甲醇為色譜純級(jí)別，其他試劑均為分析純。

1.3?內(nèi)生細(xì)菌CX33發(fā)酵液供試品的制備

取已活化的CX33菌株接種于NA液體培養(yǎng)基中，120 r/min，37 ℃振蕩發(fā)酵培養(yǎng)5 d，取出，于2 000 r/min離心10 min，得發(fā)酵液，凍干，備用。

1.4?抑菌活性檢測(cè)

取“1.3”的供試品，以適量甲醇溶解成1 mg/mL的供試品溶液，過濾（0.22 μm無(wú)菌濾器），參照文獻(xiàn)[9]進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)。

1.5?內(nèi)生細(xì)菌CX33菌株鑒定

內(nèi)生細(xì)菌CX33形態(tài)學(xué)觀察及生理生化指標(biāo)測(cè)定參照文獻(xiàn)[10]進(jìn)行。

16S rDNA序列擴(kuò)增和序列分析參照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行。

1.6?內(nèi)生細(xì)菌CX33發(fā)酵液分析

采用HPLC對(duì)CX33菌株發(fā)酵液中活性成分進(jìn)行分析。取“1.4”項(xiàng)供試品溶液，微孔濾膜過濾（0.45 μm），取濾液作為供試品溶液。分別精密吸取紫丁香苷對(duì)照品溶液及供試品溶液各10 μL注入色譜儀，色譜柱：Venusil XBP-C18柱;流動(dòng)相：甲醇-水-冰醋酸（15∶85∶1）;流速1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)269 nm。

2?結(jié)果與分析

2.1?抑菌活性檢測(cè)

刺五加內(nèi)生細(xì)菌CX33發(fā)酵液對(duì)11種致病菌均有不同程度的抑制作用，結(jié)果見表1。

2.2?內(nèi)生細(xì)菌CX33菌株鑒定結(jié)果

2.2.1?內(nèi)生細(xì)菌CX33菌株形態(tài)學(xué)觀察及生理生化指標(biāo)測(cè)定。CX33菌株形態(tài)學(xué)觀察及生理生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果見表2。

2.2.2?16S rDNA序列擴(kuò)增和序列分析。

CX33菌株P(guān)CR擴(kuò)增后得到1條1 540 bp的特異性條帶，通過GENBANK序列比對(duì)，CX33與枯草芽孢桿菌MX6（序列號(hào)：KY575151.1）株序列相似性達(dá)到96%，綜合生理生化和16S rDNA基因序列的分析結(jié)果，鑒定菌株CX33為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。菌株CX33系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1。

2.3?內(nèi)生細(xì)菌CX33發(fā)酵液分析

通過HPLC法，以紫丁香苷為對(duì)照，對(duì)CX33發(fā)酵液中活性成分進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用對(duì)照品加入法在CX33發(fā)酵液中檢測(cè)到紫丁香苷，而陰性對(duì)照（培養(yǎng)基）無(wú)干擾。其結(jié)果如圖2～5所示。

3?結(jié)論

刺五加內(nèi)生細(xì)菌CX33發(fā)酵液中存在與宿主植物刺五加相同的活性成分紫丁香苷，說明刺五加內(nèi)生細(xì)菌CX33在次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生機(jī)制方面與宿主植物刺五加有著相似之處;同時(shí)，在刺五加內(nèi)生細(xì)菌CX33發(fā)酵液中也存在大量活性代謝物，因此開展刺五加內(nèi)生細(xì)菌CX33活性代謝物研究具有重要意義，可為進(jìn)一步研究和綜合利用CX33菌株奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] LINNAKOSKI R，PUHAKKATARVAINEN H，PAPPINEN A.Endophytic fungi isolated from Khaya anthotheca in Ghana [J].Fungal ecology，2012，5：298-308.

[2] GANLEY R J，SNIEZKO R A，NEWCOMBE G.Endophytemediated resistance against white pine blister rust in Pinus monticola[J].Forest ecology and management，2008，255：2751-2760.

[3] YANG T，DAI C C.Interactions of two endophytic fungi colonizing Atractylodes lancea and effects on the hosts essential oils[J].Acta ecologica sinica，2013，33：87-93.

[4] CUI Y N，YI?D W，BAI X F，et al.Ginkgolide B produced endophytic fungus（Fusarium oxysporum）isolated from Ginkgo biloba[J].Fitoterapia，2012，83：913-920.

[5] GUIMARES D O，LOPES N P，PUPO M T.Meroterpenes isolated from the endophytic fungus Guignardia mangiferae[J].Phytochemistry letters，2012，5（3）：519-523.

[6] 鄭春英，石震華，徐翠.乳酸桿菌HD11發(fā)酵刺五加對(duì)紫丁香苷及異嗪皮啶含量的影響[J].食品科學(xué)，2012，33（23）：189-192.

[7] 裴淑蘭，劉東，劉慧芹，等.野生酸棗內(nèi)生細(xì)菌篩選、鑒定及其抑菌活性測(cè)定[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2018，45（4）：871-877.

[8] 張萍，吳丹，矯佳陳琦，等.產(chǎn)原兒茶酸北五味子內(nèi)生細(xì)菌WF17的鑒定及抑菌活性研究[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2015，15（7）：198-202.

[9] CHIKHI L，ALLALI H，BECHLAGHEM K，et al.Assessment of in vitro antimicrobial potency and free radical scavenging capacity of the essential oil and ethanol extract of Calycotome villosa subsp.intermedia growing in Algeria[J].Asian Pac J Trop Dis，2014，4（5）：356-362.

[10] BUCHANAN R E，BERGEY N E.Bergeys manual of determinative bacteriology[M].9th ed.Baltimore：Williams & Wilkins Company，1994：198.