代建麗+周斯荻+劉銘軒等

摘 要：以水提醇沉法提取白芨多糖，應(yīng)用濾紙片法研究白芨多糖對大腸桿菌、變形桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的生長抑制作用，并測定大腸桿菌菌液的電導率、堿性磷酸酶含量和蛋白質(zhì)含量探討白芨多糖的抑菌機理。結(jié)果表明，白芨多糖對4種菌的生長均有抑制作用，20mg/mL的白芨多糖抑菌效果較好，白芨多糖可導致大腸桿菌細胞壁和細胞膜的通透性增大，引起細胞內(nèi)容物外泄而起到抑菌作用。

關(guān)鍵詞：白芨多糖；抑菌活性；抑菌機理

中圖分類號 Q946.3 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2015）19-19-03

Study on the Antibacterial Activity of Bletilla striata Polysaccharide

Dai Jianli et al.

（College of Life Science，Wuchang University of Technology，Wuhan 430223，China）

Abstract：Water-soluble polysaccharides were separated from Bletilla striata by hot-water extraction and its antibacterial activity against Escherichia coli，Proteus vulgaris，Staphyloccocus aureus and Bacillus subtilis were studied with filter method. The changes in electric conductivity，alkaline phosphatase（AKP）content and protein concentration in the medium were measured to study the antibaeterial mechanism. Results showed that the polysaccharides of Bletilla striata had antibacterial activity against the four bacteria and had strong inhibition effect at the concentration of 20mg/mL. The permeability of cell membrane and cell wall of Escherichia coli were increased after treated with Bletilla striata polysaccharide，which resulted in the release of cell components.

Key words：Bletilla striata polysaccharide；Antibacterial activity；Antibaeterial mechanism

中藥白芨為蘭科植物白芨（Bletilla striata（Thunb.）Reichb.f.）的干燥塊莖，具有收斂止血、消腫生肌之功效，臨床上廣泛用于治療咳血、吐血、潰瘍疼痛、手足皸裂等癥。現(xiàn)代研究顯示，白芨的主要藥用成分為白芨膠，又稱白芨多糖[1]。白芨甘露聚糖膠漿對人上消化道出血有良好的止血療效[2]。白芨多糖能促進大鼠背部切割傷創(chuàng)面的創(chuàng)傷愈合[3]，并能促進大鼠應(yīng)激性胃潰瘍的愈合[4]。但是，有關(guān)白芨抑菌作用的研究較少。目前有少量研究表明白芨提取物具有抑菌效果，Michinori等發(fā)現(xiàn)白芨的乙醇浸提液對黃色葡萄糖菌和枯草桿菌有抑制作用[5]，陳玉等發(fā)現(xiàn)白芨水煎劑能抑制變形鏈球菌的生長[6]，白芨中起抑菌作用的有效成分及其抑菌機理尚缺乏研究。植物多糖作為一類重要的生物活性物質(zhì)，已在許多種屬中被證明具有抑菌作用[7-10]。本實驗對白芨多糖的抑菌作用和機理進行了初步研究，以拓展中藥白芨的藥用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料 白芨購自武漢國藥股份有限公司中藥飲片廠；金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、枯草芽抱桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli）、變形桿菌（Proteus vulgaris）購于武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心，武昌理工學院生科院實驗室活化保存。

1.2 方法

1.2.1 白芨多糖的提取及含量測定 白芨飲片粉碎、過篩，稱取30g，按1∶20（W/V）比例加入蒸餾水，80℃浸提2h，重復提取3次，合并提取液，過濾，濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓濃縮至稠膏狀，加3倍體積95%乙醇沉淀。過濾，取沉淀，加10mL蒸餾水溶解，Sevag法脫蛋白，透析，再次加入3倍體積95%乙醇沉淀。過濾，取沉淀，50℃干燥得白芨多糖。以葡萄糖制作標準曲線，苯酚硫酸法測定多糖含量[11]。

1.2.2 白芨多糖的抑菌試驗 將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和變形桿菌用LB活化，同時將白芨多糖稀釋成5mg/mL、10mg/mL、20mg/mL、40mg/mL4種濃度的多糖溶液，過濾除菌備用。試驗時采用濾紙片法[7]測定白芨多糖的抑菌效果，以無菌水為陰性對照，25μg/mL氯霉素為陽性對照，4種多糖溶液為處理組進行抑菌試驗，菌液濃度為108CFU/mL。以抑菌圈的大小表示抑菌活性的大小。

1.2.3 白芨多糖對大腸桿菌細胞膜通透性的影響 將白芨多糖用適量蒸餾水溶解，過濾除菌，加入到LB液體培養(yǎng)基中使其終濃度40mg/mL備用。將震蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期的大腸桿菌菌液調(diào)整濃度為108CFU/mL，轉(zhuǎn)入加有白芨多糖的LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，分別于0、1h、2h、3h、4h測定菌液的電導率[12]，以不加白芨多糖的培養(yǎng)基為對照。

1.2.4 白芨多糖對大腸桿菌細胞壁通透性的影響 將白芨多糖加入到LB液體培養(yǎng)基中使其終濃度為40mg/mL。調(diào)整培養(yǎng)至對數(shù)生長期的大腸桿菌菌液使其濃度為108CFU/mL，轉(zhuǎn)入到含有40mg/mL白芨多糖的LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，分別于0、1h、2h、3h、4h取樣5mL，3 500r/min離心10min，取上清液20μL用堿性磷酸酶檢測試劑盒和酶標儀測定堿性磷酸酶的含量[13]，以不加白芨多糖的培養(yǎng)基為對照，酶活性單位為DEA單位。

1.2.5 白芨多糖對大腸桿菌培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)濃度的影響 將白芨多糖加入到LB液體培養(yǎng)基中使其終濃度為40mg/mL。調(diào)整培養(yǎng)至對數(shù)生長期的大腸桿菌菌液使其濃度為108CFU/mL，轉(zhuǎn)入到含有40mg/mL白芨多糖的LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，分別于0、1h、2h、3h、4h用Bradford法測定菌液中的蛋白質(zhì)含量[14]，以不加白芨多糖的培養(yǎng)基為對照。

2 結(jié)果

2.1 白芨多糖的提取及含量測定 采用水提醇沉法從30g白芨飲片粉末中獲得5.56g白芨粗多糖，苯酚硫酸法測得多糖質(zhì)量為4.62g，粗多糖中多糖含量為83.1%，多糖得率為15.4%。

2.2 白芨多糖的抑菌效果 采用濾紙片法測定白芨多糖對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和變形桿菌的抑菌作用，以25μg/mL氯霉素為陽性對照，實驗結(jié)果表明，在40mg/mL濃度范圍內(nèi)，白芨多糖對四種菌的生長都有一定的抑制作用。在低濃度即多糖濃度為5mg/mL時白芨多糖對四種菌的抑制作用均不明顯，糖濃度為10mg/mL時對枯草芽孢桿菌和變形桿菌表現(xiàn)出較強的抑制作用，20mg/mL時對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出較強的抑制作用，高濃度即多糖濃度為40mg/mL時對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌表現(xiàn)出較強的抑制作用，其中，白芨多糖對大腸桿菌的抑制作用超過了陽性對照氯霉素（圖1）。

[A][B][C][D][E][F]

A：陰性對照；B：氯霉素陽性對照；C：大腸桿菌；D：變性桿菌；

E：枯草芽孢桿菌；F：金黃色葡萄桿菌

圖1 白芨多糖對四種細菌的抑菌效果

2.3 白芨多糖對大腸桿菌細胞膜通透性的影響 經(jīng)白芨多糖處理后，大腸桿菌培養(yǎng)液的電導率值明顯高于對照，在2h時最為顯著，且隨著作用時間的延長，培養(yǎng)液的電導率持續(xù)增加且均高于對照，表明白芨多糖能引起大腸桿菌細胞膜的通透性改變，使細胞膜透性增大導致細胞內(nèi)的離子外滲（圖2）。

圖2 白芨多糖對大腸桿菌細胞膜通透性的影響

圖3 白芨多糖對大腸桿菌細胞壁通透性的影響

2.4 白芨多糖對大腸桿菌細胞壁通透性的影響堿性磷酸酶存在于細菌細胞壁與細胞膜之間，正常情況下該酶不能透過細胞壁滲透到細胞外。在大腸桿菌培養(yǎng)液中添加白芨多糖后，菌液的堿性磷酸酶含量呈現(xiàn)先升后降趨勢，在培養(yǎng)2h時達到最大值，以后呈下降趨勢，但均高于對照，說明白芨多糖能夠破壞細菌細胞壁的完整性，在短時間內(nèi)造成細菌細胞壁通透性增加（圖3）。

2.5 白芨多糖對大腸桿菌培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)濃度的影響 在大腸桿菌培養(yǎng)液中添加白芨多糖后，菌液的蛋白質(zhì)含量在4h內(nèi)一直呈上升趨勢，且顯著高于對照，說明白芨多糖引起了大腸桿菌胞內(nèi)蛋白質(zhì)的外滲。胞內(nèi)蛋白的外滲進一步說明大腸桿菌細胞壁和細胞膜的通透性變大，細胞內(nèi)的一些大分子物質(zhì)可以滲出細胞。由于提取的白芨多糖沒有進一步純化，其中含有少量的蛋白質(zhì)雜質(zhì)，約為2.93μg/mL，樣品組0h的A595值要高于對照（圖4）。

圖4 白芨多糖對大腸桿菌菌液蛋白質(zhì)含量的影響

3 討論

報道表明，很多植物的多糖具有抑菌作用，其作用濃度為1%～25mg/mL[7-10]，其中葛根多糖和大豆多糖對大腸桿菌的最小抑菌濃度均為8mg/mL。本實驗據(jù)此設(shè)計了5mg/mL、10mg/mL、20mg/mL、40mg/mL4種多糖濃度，考察白芨多糖對常見的革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌及革蘭氏陰性菌大腸桿菌、變形桿菌的作用效果，結(jié)果表明，5mg/mL的白芨多糖無抑菌效果，較高濃度即20mg/mL多糖對4種菌具有較強的抑制作用。白芨多糖的有效抑菌濃度偏高，并顯著高于茶多酚[14]、蒲公英黃酮[15]等其他類型的次生物質(zhì)。

藥物的抑菌機制包括干擾細菌細胞壁的合成、抑制細菌核酸、蛋白質(zhì)的合成及損傷細菌的細胞膜等。本實驗表明，白芨多糖能改變大腸桿菌細胞壁和細胞膜的通透性，使其通透性增大，使細胞代謝發(fā)生紊亂而抑制其生長。電導率、堿性磷酸酶、胞外蛋白含量的變化規(guī)律與已有的研究基本一致[12-15]，在時間節(jié)點上略有不同。電導率的對照組2h時菌液的電導值下降，可能是由大腸桿菌吸收利用培養(yǎng)液中的NaCl引起，實驗組大腸桿菌在利用NaCl時胞內(nèi)離子有外滲，因此沒有出現(xiàn)電導值的顯著變化。白芨多糖是否存在其他的抑菌機制有待進一步研究，多糖的不同組分是否存在功能上的差異也需要進一步實驗觀察。

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（責編：張長青）