張翠榮??+李明??+李榮玉??

摘要：以稻瘟病菌為供試靶標，采用生長速率和孢子萌發(fā)測定法，對魚腥草、夾竹桃、馬尾松、姜和香樟的乙醇粗提物進行了抑菌活性測定。結(jié)果顯示，5種植物粗提液對稻瘟病菌均有抑制作用，在濃度為40 mg/mL時，馬尾松對該菌的菌絲生長及孢子萌發(fā)抑制率最高，分別為62.23%和65.54%，其EC50為21.75 mg/mL和19.38 mg/mL，其次是姜和夾竹桃，其中魚腥草和香樟的抑菌活性相對較弱。

關(guān)鍵詞：稻瘟病菌；乙醇粗提物；抑菌活性

中圖分類號： S482.2+92；S435.111.4+1文獻標志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0162-02

21世紀全球農(nóng)業(yè)發(fā)展的一個重要趨勢是更加注重農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全，從天然植物中提取殺蟲殺菌活性物質(zhì)防治病蟲害，已成為研究熱點，并對現(xiàn)代農(nóng)藥研究具有重要意義。

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，全球約有1/2的人口以稻米作為主食，其中水稻稻瘟病是危害水稻的三大病害之一[1-2]，它是由水稻稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）引起的真菌性病害[3]。目前稻瘟病主要依靠化學防治，雖然化學防治具有效果顯著、廣譜性強、易推廣等優(yōu)點，但在保障人類獲得豐厚農(nóng)產(chǎn)品的同時，也給環(huán)境帶來了嚴重的污染[4-5]。

植物源殺菌劑是從某些植物的葉、花、莖、根、果實等部位分離提取的具有殺菌作用的活性物，植物殺蟲殺菌資源豐富，對環(huán)境、植物本身以及害蟲天敵均無影響，也不易使有害生物產(chǎn)生抗藥性，所以植物源殺菌劑成為目前農(nóng)藥研究開發(fā)的熱點。例如大蒜中的大蒜素、蠶豆中的蠶豆酮等均可有效地抑制或殺死某些病原菌的生長發(fā)育[6-10]。植物通過長期進化而產(chǎn)生種類繁多的活性次生代謝物是植物抵御病原菌的重要武器，這些類型多樣的次生代謝物為開發(fā)新農(nóng)藥提供了無限的研究資源。

國內(nèi)對于防治水稻稻瘟病的植物源藥劑的開發(fā)也有初步研究，有研究表明山蒼子植物中含有對水稻稻瘟病菌毒殺作用的物質(zhì)等。本研究探索5種植物（魚腥草、夾竹桃、馬尾松、姜和香樟）的乙醇粗提物對水稻稻瘟病的生物活性作用，以期為基于植物源藥劑防治水稻稻瘟病提供科學依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

供試植物均采摘于貴州大學農(nóng)學院，植物名錄見表1。

1.2試驗方法

1.2.1植物的預(yù)處理及粗提物的制備將5種植物洗凈置于陰涼處晾干，然后放在恒溫干燥箱中以60 ℃的溫度烘干，小心取出植物分別放入研缽中充分研磨，直至成細粉末狀，將獲得干粉稱質(zhì)量后置于密封瓶內(nèi)保存?zhèn)溆?。采用超聲波提取法進行粗提物的制備，提取溶劑為無水乙醇。

分別稱取5種植物干粉各10 g置于250 mL錐形瓶中，按照料液比1 g ∶[KG-*3]20 mL加入無水乙醇中浸漬、振蕩、低溫靜置，真空抽濾、棄廢渣、減壓濃縮獲得浸膏狀植物乙醇粗提物。用60%乙醇溶液溶解5種植物粗提物，適量添加0.1%的吐溫-80，分別制成濃度為10、20、40 mg/mL的供試溶液。將試驗分5組進行，分別為魚腥草、夾竹桃、馬尾松、生姜和香樟乙醇粗提物各濃度供試液，每個處理3次重復。

1.2.2菌絲生長抑菌活性的測定采用菌絲生長速率抑制法，分別取上述5種已經(jīng)配制成系列濃度梯度的植物粗提物，加入到融化好的PDA培養(yǎng)基中，滅菌，制成系列濃度梯度的含藥培養(yǎng)基平板。取供試的稻瘟病菌菌種，用直徑為6 mm的打孔器在菌落邊緣打取菌餅，然后將菌餅移到上述含藥的培養(yǎng)基平板中央，以不加藥的平板培養(yǎng)基為對照，每個處理3次重復，25 ℃全黑暗培養(yǎng)?！笆弊纸徊娣y定各處理的菌落直徑，并根據(jù)公式計算菌絲抑制生長率及EC50值[11]。

抑制生長率=[（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-菌餅直徑）]×100%。

采用回歸分析法對5種植物乙醇粗提物各處理濃度的對數(shù)值（x）和菌絲生長抑制率的概率值（y）進行分析處理，計算出5種植物乙醇粗提物對供試菌株的EC50值。

1.2.3孢子萌發(fā)抑菌活性的測定采用米糠培養(yǎng)基產(chǎn)孢的方法，取培養(yǎng)好的菌絲塊，分多點接種到米糠培養(yǎng)基上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待菌絲長滿，將少許無菌水倒入培養(yǎng)皿中，用毛筆輕輕刷洗過后，再置于365 nm黑光燈下培養(yǎng)，48 h后，培養(yǎng)基表面即產(chǎn)生大量孢子，表現(xiàn)為1層青灰色的新鮮霉層，即為稻瘟病菌孢子。刷洗霉層，過濾、鏡檢，調(diào)配成所需濃度的孢子懸浮液，在顯微鏡下觀察，以不加藥劑的孢子懸浮液為對照，分別在處理的孢子懸浮液中加入不同濃度的不同藥劑，每個濃度處理設(shè)3個重復[12-15]。

將各處理的孢子懸浮液置于搖床中培養(yǎng)24 h后，鏡檢各處理的孢子萌發(fā)情況，記錄200個孢子中萌發(fā)的孢子數(shù)。孢子萌發(fā)抑制率=（對照萌發(fā)率-處理萌發(fā)率）/對照萌發(fā)率×100%。計算抑制率，求出毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)r和EC50值[16]。

2結(jié)果與分析

2.1植物乙醇粗提物對菌絲的抑制作用

由表2可知，5種植物乙醇粗提物對稻瘟病菌菌絲均有抑制作用，在測定的濃度下，隨著各粗取物處理濃度的升高，稻瘟病菌菌落增長直徑遞減，抑制率升高，粗提物濃度與抑制率正相關(guān)。當濃度為40 mg/mL時，馬尾松粗提物對稻瘟病菌菌絲的抑制率為62.23%，姜粗提物抑制率也達到了5123%，其次是夾竹桃和香樟，在相同濃度下，魚腥草對稻瘟病菌菌絲生長的抑制率最低。

2.2植物乙醇粗提物對孢子萌發(fā)的抑制作用

從表4可以看出，5種植物乙醇粗提物對稻瘟病菌孢子萌發(fā)均有抑制作用，其中馬尾松對孢子萌發(fā)的抑制效果最明顯，隨著濃度升高，抑制率逐漸上升，當濃度為10 mg/mL時，抑制率達到了42.56%；當濃度為40 mg/mL時，抑制率達到了65.64%。夾竹桃、姜和香樟的粗提物在濃度是 40 mg/mL 時，其抑制率均超過40%。其中魚腥草的孢子萌發(fā)率相對較

3討論

植物的抑菌殺菌作用是長期與昆蟲和病原菌進化產(chǎn)生的結(jié)果，主要依賴于植物的次生代謝產(chǎn)物[17-18]。該試驗探究了5種植物乙醇粗提物對稻瘟病菌菌絲生長及孢子萌發(fā)的影響，結(jié)果表明5種植物粗提液對稻瘟病菌均有抑制作用，在濃度為40 mg/mL時，馬尾松對該菌的菌絲生長及孢子萌發(fā)的抑制率最高，分別為62.23%和65.64%，抑制效果顯著優(yōu)于其他4種植物粗提物；當濃度為20 mg/mL時，姜和夾竹桃對菌絲抑制率為44.17%和34.98%；其中魚腥草對該菌的抑制活性相對較弱。線性毒力方程結(jié)果分析，5種植物粗提物處理濃度與對菌絲生長及孢子萌發(fā)的抑制率呈線性關(guān)系，其中馬尾松的EC50值為21.75 mg/mL和19.38 mg/mL。不同植物中存在不同的抗菌活性物質(zhì)，它們的作用機制存在差異[19]。

本試驗只研究了5種植物的乙醇粗提物，其有效成分復雜，為了解對稻瘟病菌有生物活性的主要成分及相互間的作用效果，有必要對高活性物質(zhì)分離、純化、分析其活性及化學成分，且其具體抑菌機理有待進一步深入研究。

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