張光輝，嚴小敏，邵小燕，魏士鈞

(重慶國聯(lián)干細胞技術(shù)有限公司，重慶 401325)

據(jù)國家癌癥中心發(fā)布的2017年最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，我國每年新發(fā)癌癥病例達429萬，占全球新發(fā)病例的20%，死亡281萬例[1]。自然殺傷(Natural killer，NK)細胞是機體抗腫瘤的、抗感染的第一道防線，對腫瘤和病毒的識別和殺傷無組織相容性復合體(Major Histocompatibility Complex，MHC)限制、不依賴于抗體[2]，因此在腫瘤的免疫治療領域有較好的發(fā)展前景。筆者就NK細胞在腫瘤免疫治療中的研究現(xiàn)狀及應用進行綜述。

1 NK細胞概述

1.1 NK細胞的概念

NK細胞是具有多種免疫學功能的淋巴樣細胞，約占外周血淋巴細胞的10%～15%。人的NK細胞一般指CD3-CD56+淋巴細胞，根據(jù)CD56在NK細胞表面表達密度的差異，可將NK細胞分為CD56dim和CD56bright兩個亞群[3]。CD56dim亞群主要存在于外周血和脾臟中，可以通過表達穿孔素的方式來殺傷腫瘤，CD56bright亞群主要存在于淋巴結(jié)、扁桃體中，可以分泌干擾素γ、白細胞介素(IL)12、15、18等細胞因子來實現(xiàn)免疫功能[4]。

NK細胞的生成發(fā)育機制目前仍無定論，較統(tǒng)一的觀點是：NK細胞起源于骨髓造血干細胞，由CD34+造血祖細胞(HPC)分化而來。IL-2、IL-15在NK細胞的發(fā)育過程中起著關鍵作用，可以在無其他細胞因子存在下誘導HPC分化為NK細胞。NK細胞在分化過程中根據(jù)階段的不同被分成了CD56dim和CD56bright兩個不同亞群，兩個亞群在人體免疫系統(tǒng)中都發(fā)揮著重要的作用[5]。

1.2 NK細胞的特性

NK細胞形態(tài)與T細胞和B細胞不同，其體積較大，屬于大顆粒淋巴細胞。NK細胞對靶細胞的識別無MHC限制性，不依賴于抗體，無需致敏就可以發(fā)揮殺傷腫瘤和病毒的功能[6]。NK細胞表面具有MHC-I的抑制性特異性受體，可以與自體細胞表面的MHC-I結(jié)合以避免對其殺傷，而腫瘤細胞、病毒、衰老型細胞等常出現(xiàn)該信號的降低或缺損，因此NK細胞可發(fā)揮對該類細胞的殺傷作用[7]。NK細胞可分泌多種細胞因子，如穿孔素、細胞毒因子、TNF、IFN-γ、IL-2等來發(fā)揮免疫監(jiān)視功能。NK細胞有多種受體及細胞內(nèi)信號分子參與執(zhí)行效應功能，發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫和造血作用以及直接殺傷靶細胞的作用[8]。另外，NK細胞對靶細胞的殺傷作用出現(xiàn)早，在體外1 h、體內(nèi)4 h即可見到殺傷效應。因此，NK細胞也被稱為人體固有免疫系統(tǒng)的第一道防線。

2 NK細胞的抗腫瘤機制

NK細胞具有較廣的抗瘤譜，NK細胞殺傷靶細胞的機制為：①釋放穿孔素和顆粒酶引起靶細胞壞死或凋亡。NK細胞在體內(nèi)接觸到腫瘤細胞之后，通過胞吐將含有穿孔素和顆粒酶的細胞毒性物質(zhì)釋放，穿孔素通過聚合作用在靶細胞表面形成小孔，釋放的顆粒酶進入靶細胞，可通過多種不同途徑激起細胞的死亡，如激起caspases的鏈鎖反應，引起靶細胞DNA降解活動，然后裂解致使腫瘤細胞凋亡[9]。②死亡受體作用途徑?；罨蟮腘K細胞可以表達TNF家族的成員配體，如FasL和TRAIL等，通過對腫瘤靶細胞表面因子的相關受體結(jié)合，誘導腫瘤細胞的凋亡。其他成員配體也對腫瘤細胞的生長有一定的抑制作用[10]。③NK細胞分泌多種細胞因子。NK細胞可分泌多種效應性因子，如IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-5、IL-10、IL-13、粒-巨噬細胞集落刺激因子等，可以抑制腫瘤細胞的增殖并殺傷腫瘤細胞[11]。④抗體依賴細胞介導的細胞毒性(ADCC)。NK細胞通過表面受體CD16與靶細胞進行結(jié)合，通過信號傳導殺傷靶細胞。并且，NK細胞自身所分泌的多種因子可以使其殺傷靶細胞的能力變強[12]。

3 NK細胞在腫瘤治療中的應用

3.1 NK細胞擴增

NK細胞是否能夠在腫瘤治療中發(fā)揮作用，最大的關鍵在于細胞的數(shù)量和對腫瘤細胞的殺傷能力。細胞的培養(yǎng)過程大致為：采集供者外周血，分離獲取單個核細胞(PBMC)進行誘導擴增。整個培養(yǎng)周期約10～23 d，常用的誘導因子主要有IL-2CD3、IL-15、IL-21等。NK細胞的擴增效率在200～1000倍，純度達60%～90%[13]。有數(shù)據(jù)顯示，NK細胞凍存后復蘇不會影響細胞的表型，也不會對細胞的殺傷能力產(chǎn)生明顯的影響。因此，前期將擴增后的細胞進行凍存，可有效解決細胞使用時的不確定性，便于臨床應用[14]。

另外，也有使用臍帶血、細胞株、人胚胎干細胞、誘導多能干細胞等來培養(yǎng)NK細胞。培養(yǎng)方法上，使用經(jīng)輻照的滋養(yǎng)層細胞刺激活化PBMC來提高NK擴增數(shù)量和細胞純度。但這些方法都帶入了異體的基因，在安全性上還需要更多的數(shù)據(jù)來驗證。

3.2 自體NK的免疫治療

1985年，Rosenberg最早使用NK細胞聯(lián)合IL-2進行腎癌、黑色素瘤的治療，有效率為20%～30%，但大劑量的IL-2會引起較大的副作用[15]。目前，經(jīng)過對NK細胞培養(yǎng)方法的不斷改進，在安全性上得到了提高，細胞毒性也隨之增強。臨床研究方面，Leivas A等[16]使用自體NK細胞治療了5例復發(fā)或難治性骨髓瘤患者，4名患者顯示疾病穩(wěn)定，其中2名患者骨髓浸潤減少50%，并且多次輸注的耐受良好，輸注是安全有效的。Tong AA等[17]使用NK細胞治療移性或復發(fā)性尤文氏肉瘤，認為NK細胞顯著降低了肺轉(zhuǎn)移的風險，對原發(fā)性腫瘤有一定的限制作用。杜波等[18]對86例原發(fā)性肝癌患者進行了NK細胞治療，結(jié)果顯示患者的免疫功能指標均有所提高，肝功能指標有所改善，預后良好，1年生存率為88.37%。李紅梅等[19]選取了復發(fā)性卵巢癌患者60例，患者NK細胞治療后腫瘤壞死因子-α、γ-干擾素、白細胞介素-2細胞因子顯著高于未給予NK細胞治療者，并且患者免疫功能指標均顯著升高。

目前，使用自體NK細胞來治療腫瘤，使部分患者得到緩解，血液免疫性指標有所提升，部分腫瘤進展得到限制，預后良好，生活質(zhì)量也獲改善。總體來說，自體NK輸注對部分患者的腫瘤治療有一定的治療效果，但是臨床也有部分患者效果不明顯，可能有以下原因影響療效：①部分腫瘤細胞表面表達MHC，造成該腫瘤細胞發(fā)生逃逸，無法發(fā)揮NK細胞的殺傷作用。②部分腫瘤患者體內(nèi)的免疫功能本身存在缺陷，導致自體培養(yǎng)擴增的NK細胞功能不強，不能達到殺傷腫瘤的效果。

3.3 異體NK的免疫治療

鑒于腫瘤患者自身的NK細胞存在擴增的難度，擴增成功也可能存在細胞毒性及功能不強的缺點，因此許多學者試圖通過異體NK細胞來應用于腫瘤的免疫治療。異體細胞來源主要是同源異體的健康人群細胞、建立符合臨床治療要求的細胞系等來實現(xiàn)。

Yang Y等[20]使用同種異體NK細胞治療晚期淋巴瘤和晚期實體瘤，觀察到使用3×107細胞/kg分三次輸注是可耐受的，未出現(xiàn)顯著不良反應，47.1%的患者病情穩(wěn)定，而且NK細胞在維持宿主免疫應答的效應方面也表現(xiàn)出有效性。Curti等[21]入組了經(jīng)化療后完全緩解的急性髓性白血病(AML)患者，后回輸同種異體半相合的NK細胞進行治療，認為可以提高患者的預后效果和生活質(zhì)量。Liang S等[22]對使用自體NK和異體NK細胞治療復發(fā)性乳腺癌的患者進行了對比，認為異體NK細胞治療患者在臨床療效、生活質(zhì)量、免疫功能、循環(huán)腫瘤細胞水平等相關指標提高方面優(yōu)于自體NK。

目前，異體NK細胞主要是使用半相合的供者，有研究認為健康供者的細胞所培養(yǎng)出的NK在功能上更強，療效更好。但是異體NK的使用也還存在很多未知的問題，如異體NK回輸入患者體內(nèi)后的生存期，對患者自身的免疫系統(tǒng)影響如何，異體輸注的安全性、不良反應等，還需要進一步的臨床研究。

3.4 臍血來源NK的免疫治療

臍血來源的NK細胞也屬于異體NK的范疇。臨床上常將臍血作為醫(yī)療垃圾進行處理，可以通過收集臍血進行誘導培養(yǎng)獲取NK細胞來應用于腫瘤的治療，以達到變廢為寶的目的。

Shah N等[23]使用人工抗原呈遞飼養(yǎng)細胞(aAPC)誘導臍血PBMC來擴增NK細胞，經(jīng)過14 d的培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)新鮮臍血培養(yǎng)NK細胞的平均增殖倍數(shù)為1848倍，凍存復蘇臍血的增殖倍數(shù)為2389倍，NK細胞純度>95%，CD3+細胞低于1%。HerreraL等[24]比較了兩種基質(zhì)細胞系OP9和M2-10B4誘導臍血PBMC擴增NK細胞的潛力，發(fā)現(xiàn)誘導后的NK細胞可以表達與正常人體相似水平的顆粒酶B和穿孔素，對K562靶細胞的脫粒和細胞毒活性都非常相似。認為可以使用臍血擴增大量的成熟和有功能的NK細胞來用于腫瘤的免疫治療。

3.5 CAR-NK的免疫治療

經(jīng)過二十多年的研究及發(fā)展，嵌合抗原受體(Chimeric Antigen Receptor，CAR)修飾T細胞的研究快速發(fā)展。2017年8月30日，美國食品及藥品管理局(FDA)批準了諾華集團的CAR-T療法Kymriah，用于治療25歲以下人群的急性淋巴細胞白血病。隨后，KitePharma的CAR-T療法Yescarta上市，用于治療罹患特定類型的大B細胞淋巴瘤成人患者。國內(nèi)，已有多家公司向中國國家食品藥品監(jiān)督管理總局提交CAR-T療法的臨床實驗申請并獲受理，這將推動CAR-T療法在腫瘤治療中的進一步發(fā)展。CAR-T細胞在臨床治療中也存在較多的難點，如細胞因子風暴、脫靶效應等，而且CAR-T細胞治療目前主要針對于血液系統(tǒng)疾病，對實體瘤的治療效果還在研究當中。而NK細胞具有獨特的腫瘤識別及殺傷能力，被認為可以通過嵌合抗原受體的修飾而發(fā)揮強大的殺瘤作用。目前，科學家已經(jīng)成功轉(zhuǎn)導人類原代NK細胞和NK-92細胞系，用于開展針對血液系統(tǒng)腫瘤和實體瘤的臨床前和臨床研究。PinzKG等[25]使用anti-CD4CAR-NK-92細胞來治療外周T細胞淋巴瘤，該細胞在體內(nèi)能有效地靶向殺傷KARPAS-299細胞，認為CAR-NK細胞可以作為治療外周T細胞淋巴瘤和CD4+T細胞惡性腫瘤。ChenX等[26]使用EGFR-CAR改造的NK-92細胞和原代NK細胞，體外實驗顯示了對乳腺癌細胞系MDA-MB和MDA-MB-231腫瘤細胞的強大殺傷作用，認為經(jīng)改造的CAR-NK細胞是治療乳腺癌的潛在有效策略。GenBler S等[27]發(fā)現(xiàn)經(jīng)EGFR/EGFRvIII雙重靶向修飾的CAR-NK細胞降低了免疫逃逸的風險，表現(xiàn)出用于膠質(zhì)母細胞瘤的過繼性免疫治療的潛力。Oelsner S等[28]通過慢病毒基因轉(zhuǎn)移工程改造NK-92細胞，以表達靶向CD19并含有人CD3，復合CD28-CD3ζ的嵌合抗原受體或CD137-CD3ζ信號傳導結(jié)構(gòu)域，該細胞對B細胞白血病和淋巴瘤細胞都具有強大的殺傷能力，認為可作為治療B細胞惡性腫瘤的手段。

從目前的臨床研究來看，絕大多數(shù)接受CAR-NK治療的患者并沒有對細胞產(chǎn)生排斥，表現(xiàn)出較好的臨床安全性。另外，清除T細胞的異體NK細胞不會造成移植物抗宿主病(GVHD)，并且NK細胞擁有更短的生理周期，更有效的細胞溶解能力。相對于CAR-T，可能CAR-NK會擁有更好的發(fā)展前景。

4 結(jié)束語

近年來，NK細胞的體外大規(guī)模擴增方法有了較大的進展，細胞數(shù)量、表型、殺傷能力基本上能滿足臨床研究使用，這有利于進一步推進NK細胞在腫瘤治療的發(fā)展進程。體外大規(guī)模擴增需要嚴格的硬件及軟件管理，需要經(jīng)過長期培訓的專業(yè)技術(shù)人員來完成制備及檢測，才能保證細胞在臨床研究中的安全性和有效性。另外，在生產(chǎn)制備過程中還應避免引入外源基因，使用安全必要的制備原料，接觸細胞的相關器材需要進行驗證，檢測過程要對細胞的數(shù)量、表型、細胞殺傷能力、無菌、內(nèi)毒素、支原體等進行檢驗，相關的檢驗方法有依據(jù)的應按中國藥典進行檢驗，中國藥典方法不適宜細胞檢測或未收錄的應進行相關檢驗方法的驗證。綜上所述，只有在保證細胞的安全性和有效性，才能發(fā)揮細胞治療的強大功效，才能使NK細胞在腫瘤免疫治療中的作用得到進一步發(fā)展。