王澤興 佟毅 袁敬偉 祁德福

摘 ?????要：以全玉米粉為原料，對(duì)生料發(fā)酵乙醇的工藝進(jìn)行研究，通過單因素實(shí)驗(yàn)以及響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)探討原料粒度、底物濃度、生料酶添加量以及糖化酶添加量等因素對(duì)發(fā)酵的影響。結(jié)果表明，全玉米粉生料發(fā)酵乙醇的最佳工藝條件為50目全玉米粉為原料，底物濃度為37%，生料酶1.25%（w/w），加入酵母活化液（干酵母加量0.05%），并添加氮源尿素以及青霉素，恒溫32 ℃發(fā)酵85 h，酒份能夠達(dá)到19.86%（v/v），淀粉利用率為90.25%，響應(yīng)面分析R-sq>80%，R-sq（調(diào)整）>80%，表示所建立的模型對(duì)異變有足夠的解釋能力。

關(guān) ?鍵 ?詞：響應(yīng)面法;生料發(fā)酵;酒精

中圖分類號(hào)：TQ 920.6 ??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A ??????文章編號(hào)： 1671-0460（2019）04-0834-05

Abstract： The fermentation process for producing ethanol with all corn flour as raw material was studied. The influences of raw material granularity， substrate concentration， raw enzyme dosage and glycosylase dosage on the fermentation were investigated through single factor experiment and response surface optimization experiment. The results showed that the best conditions for the fermentation process were as follows： the raw material 50 mesh corn flour， the substrate concentration 37%， the enzyme dosage 1.25%（w/w）， and the yeast activator 0.05% of dry yeast， adding nitrogen urea and penicillin， the constant temperature 32 ℃，the fermentation time 85 h. Under above conditions， the ethanol content reached 19.86%（v/v）， the starch utilization rate was 90.25%， the response surface analysis R-sq>80%， R-sq（adjustment）>80%， indicating that the established model was sufficient to explain the variation.

Key words： Response face method; Fermentation of raw materials; Alcohol

由于世界能源危機(jī)，伴隨著節(jié)能環(huán)保理念的誕生，日本人最早提出了生料發(fā)酵的概念。隨著酶工程的發(fā)展，我國的生料發(fā)酵研究應(yīng)用發(fā)展迅速 [1]。從字面意思就能理解，生料發(fā)酵就是在發(fā)酵中不存在高溫蒸煮的過程，微生物直接作用于底物進(jìn)行發(fā)酵。生料發(fā)酵與傳統(tǒng)熟料發(fā)酵相比，發(fā)酵條件溫和，節(jié)省了蒸煮過程帶來的能源消耗，從而降低生產(chǎn)成本費(fèi)用，增強(qiáng)產(chǎn)品和企業(yè)的競(jìng)爭(zhēng)力[2]。

生料發(fā)酵應(yīng)用于酒精生產(chǎn)行業(yè)中，生料發(fā)酵生產(chǎn)酒精與熟料發(fā)酵生產(chǎn)酒精工藝對(duì)比，不存在蒸煮工段和冷卻糖化工段，這就減少了大約30%～40%的高壓蒸煮工段的能耗與汽耗，也減少了后續(xù)投入生產(chǎn)冷卻水的部分成本，進(jìn)一步簡(jiǎn)化工藝，使勞動(dòng)強(qiáng)度大幅下降，降低生產(chǎn)成本[3，4]。

2017年9月，國家發(fā)改委、國家能源局、財(cái)務(wù)部等十五部委出臺(tái)的《關(guān)于擴(kuò)大生物燃料乙醇生產(chǎn)和推廣使用車用乙醇汽油的實(shí)施方案》規(guī)定。按照規(guī)劃要求，2020年我國所有車用汽油均改為乙醇汽油，當(dāng)前我國車用汽油表觀消費(fèi)量為1.23億t，2020年我國汽油消費(fèi)量將達(dá)到1.5億t，那么按10%組分計(jì)算，燃料乙醇消費(fèi)量為1 500萬t，是當(dāng)前消費(fèi)量的5倍，市場(chǎng)空間巨大[5- 8]。

響應(yīng)面分析法（Response Surface Methodology，簡(jiǎn)稱RSM），對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行合理化綜合分析，通過試驗(yàn)設(shè)計(jì)、建立模型、分析模型合理性和尋求最優(yōu)解等步驟，經(jīng)過眾多試驗(yàn)與統(tǒng)計(jì)技術(shù)論證，來解決實(shí)際生產(chǎn)中存在問題的有效方法，該方法在生物發(fā)酵方面已有廣泛應(yīng)用[9-13]，本試驗(yàn)采用全玉米粉為原料，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)研究后，通過響應(yīng)面法對(duì)生料發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的工藝研究。

1 ?實(shí)驗(yàn)部分

1.1 ?材料與試劑

1.1.1 ?試驗(yàn)材料

全玉米粉，淀粉含量65.13%;安琪超級(jí)釀酒干酵母（安琪酵母股份有限公司生產(chǎn)）;生料預(yù)液化酶制劑（商品酶制劑）;生料酶（商品酶制劑）;葡萄糖（分析純）;氫氧化鈉（分析純）;鹽酸（分析純）;硫酸（分析純）;蘇宏GA475（諾維信公司糖化酶，酶活力10～13萬u/mL）;尿素;青霉素。

1.1.2 ?主要試劑

裴林試劑甲乙液、0.5%次甲基藍(lán)溶液、0.25%葡萄糖溶液。

1.2 ?儀器與設(shè)備

液相色譜（Agilent 1200 安捷倫科技發(fā)展有限公司）;顯微鏡（尼康50I）;分析天平（Mettler ML6002T 梅特勒- 托利多儀器上海有限公司）;離心機(jī)（3-18k Sigma 公司）;水浴鍋（HWS-28 上海一恒科技有限公司）;搖床（ZHWY-2112F 上海智城分析儀器制造有限公司）;黏度計(jì)（NDJ-5S 上海恒平科學(xué)儀器有限公司）;pH 計(jì)（FE-28 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）。

1.3 ?檢測(cè)方法

1.3.1 ?殘?zhí)堑臏y(cè)定方法

斐林試劑法[14]檢測(cè)發(fā)酵后殘還原糖、殘總糖、過濾總糖。

1.3.2 ?黏度的測(cè)定方法

使用黏度計(jì)NDJ-5 進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 ?酵母測(cè)定

顯微鏡下觀察，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

1.3.4 ?成熟醪內(nèi)各個(gè)組分的測(cè)定方法

高效液相色譜法：采用安捷倫1200 型色譜進(jìn)行測(cè)定，流動(dòng)相：0.005 mol/L H2SO4;色譜柱：伯樂HPX-87H，300 mm×7.8 mm;泵流速：0.6 mL/min;柱溫：65 ℃;RID溫度：50 ℃;進(jìn)樣量15 μL;運(yùn)行時(shí)間30 min[15]。

1.4 ?實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 ?酵母活化

按照0.05%加入安琪超級(jí)釀酒高活性干酵母，稱取10 g干酵母至三角瓶中，加入143 g活化水（35 ℃一次水），攪拌均勻后，置于35 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，活化 20 min后取出，向發(fā)酵體系中添加2.5 mL活化液。

1.4.2 ?發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

取工廠生產(chǎn)線玉米原料，粉碎過篩，按照一定配料濃度進(jìn)行拌料，調(diào)節(jié)pH至4.4～4.6，加入生料預(yù)液化酶制劑，在50～55 ℃下浸泡1 h，在60～65 ℃下保持0.5 h后冷卻至32 ℃，稱取液化醪300 g至錐形瓶中，加入酵母活化液、生料酶、尿素以及青霉素，恒溫32 ℃發(fā)酵85 h時(shí)。

1.4.3 ?醪液中乙醇含量數(shù)據(jù)檢測(cè)

依照液相色譜法檢測(cè)醪液中酒精含量。

1.4.4 ?單因素實(shí)驗(yàn)

通過實(shí)驗(yàn)考察原料粒度、發(fā)酵時(shí)間、生料酶加量、底物濃度4個(gè)單因素對(duì)玉米生料發(fā)酵效果的影響。

1.4.5 ?響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，采用Minitab軟件，以A（原料粒度）、B（發(fā)酵時(shí)間）、C（生料酶加量）、D（底物濃度）、Y（淀粉出酒率）作為響應(yīng)指標(biāo)，驗(yàn)證各個(gè)單因素A、B、C、D交互作用對(duì)Y的影響，尋找各個(gè)單因素水平組成的最佳發(fā)酵條件。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 ?原料粒度對(duì)發(fā)酵的影響

取20目篩、40目篩、60目篩粉碎玉米原料，按30%濃度配料，調(diào)節(jié)pH至4.4，加入生料預(yù)液化酶制劑0.5%（w/w），在55 ℃浸泡1 h后再60 ℃水浴鍋中維持保持0.5 h，取出后冷卻至32 ℃，稱取液化醪300 g至錐形瓶中，加入酵母活化液（干酵母加量0.05%），加入生料酶1.0%（w/w），尿素以及青霉素，恒溫32 ℃發(fā)酵85 h（圖1）。

由圖1可以看出，隨著原料粒度的增加，粉碎粒度越細(xì)，試驗(yàn)組酒份逐漸增加，但通過圖中數(shù)據(jù)能夠看到隨著原料粒度的增加，發(fā)酵殘總糖也會(huì)隨之升高。粒度增加，導(dǎo)致淀粉粒越小，這就使總體的淀粉顆粒表面積增加，并且越容易形成懸濁液，糖化酶和酵母與淀粉顆粒發(fā)生相互作用幾率增加，化學(xué)反應(yīng)就更加充分，有利發(fā)酵的順利進(jìn)行[16]。但是如果將淀粉顆粒粉碎的越細(xì)，越小，該過程中消耗能源也將隨之增長，且增加明顯。因此并不是顆粒越小越好。故而綜合多方面因素，選擇40目粒度進(jìn)行發(fā)酵是比較恰當(dāng)?shù)摹?/p>

2.1.2 ?底物濃度對(duì)發(fā)酵的影響

取40目全玉米粉，分別按照20%、25%、30%、35%、40%濃度進(jìn)行配料，調(diào)節(jié)醪液pH至4.4，加入生料預(yù)液化酶制劑0.5%（w/w），在55 ℃浸泡1 h后再60 ℃水浴鍋中維持保持0.5 h，取出后冷卻至32 ℃，稱取液化醪300 g至錐形瓶中，加入酵母活化液（干酵母加量0.05%），加入生料酶1.0%（w/w），尿素以及青霉素，恒溫32 ℃發(fā)酵85 h（圖2）。

從圖2可以看出，隨著配料濃度的增加，乙醇含量也隨之增加，這和RASMUS D 等的報(bào)道的結(jié)論相同[17]，本實(shí)驗(yàn)中酒份在35%時(shí)達(dá)到最高，爾后40%濃度下的乙醇含量略低于35%濃度。底物濃度增加，糖含量也增加，酵母可利用的糖非常充分，而在增加到一定程度時(shí)，較高的糖含量以及乙醇會(huì)抑制酵母的生長活動(dòng)，導(dǎo)致乙醇產(chǎn)率降低[18]，并且過高的發(fā)酵濃度會(huì)對(duì)后期蒸餾工序帶來較大負(fù)擔(dān)，故而平衡生產(chǎn)才能產(chǎn)出最大效益，通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，配料濃度在35%時(shí)能夠達(dá)到乙醇最大產(chǎn)量。

2.1.3 ?發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵的影響

取40目全玉米粉，配料濃度30%，調(diào)節(jié)醪液pH至4.4，加入生料預(yù)液化酶制劑0.5%（w/w），在55 ℃浸泡1 h后再60 ℃水浴鍋中維持保持0.5 h，取出后冷卻至32 ℃，稱取液化醪300 g至錐形瓶中，加入酵母活化液（干酵母加量0.05%），加入生料酶1.0%（w/w），添加氮源尿素以及青霉素，恒溫32 ℃發(fā)酵，分別在發(fā)酵75、80、85、90 h取樣進(jìn)行檢測(cè)（圖3）。

由圖3可以看出，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，酒份逐漸增高，并且在發(fā)酵85 h酒份達(dá)到最高，后續(xù)再進(jìn)行發(fā)酵，酒份反而出現(xiàn)降低的情況，在發(fā)酵達(dá)到一定時(shí)間后，隨著乙醇的產(chǎn)出變慢，乙醇的含量隨著揮發(fā)、發(fā)酵醪內(nèi)形成其他化合物等因素，導(dǎo)致發(fā)酵時(shí)間過長會(huì)影響酒精得率[19]，根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，優(yōu)先選擇發(fā)酵85 h。

2.1.4 ?生料酶加量對(duì)發(fā)酵的影響

取40目全玉米粉，配料濃度35%，調(diào)節(jié)醪液pH至4.4，加入生料預(yù)液化酶制劑0.5%（w/w），在55 ℃浸泡1 h后再60 ℃水浴鍋中維持保持0.5 h，取出后冷卻至32 ℃，稱取液化醪300 g至錐形瓶中，加入酵母活化液（干酵母加量0.05%），分別制定生料酶加量為0.5%1.0%、1.5%、2.0%（w/w），并添加氮源尿素以及青霉素，恒溫32 ℃發(fā)酵85 h（圖4）。

隨著生料酶加量增大，發(fā)酵乙醇含量也隨之增加，可以看出從0.05 kg/t玉米粉增加至0.1 kg/t玉米粉時(shí)，乙醇含量增加明顯，再從0.1 kg/t玉米粉向上增加時(shí)，乙醇含量是增加趨勢(shì)，但增加的幅度逐步變小，說明在生料酶加量在0.1 kg/t玉米粉時(shí)，既能夠達(dá)到發(fā)酵乙醇含量最大化，并且可以維持在較低的成本條件下。

2.2 ?響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果和分析

為了明確全玉米粉生料發(fā)酵的工藝最佳組合，通過以上單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選取A-原料粒度、B-發(fā)酵時(shí)間、C-生料酶加量、D-底物濃度自變量，乙醇酒份（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2-4和圖5-10。

在圖5中，是原料粒度和發(fā)酵時(shí)間交互作用對(duì)酒份的影響，當(dāng)固定生料酶和底物濃度時(shí)，原料粒度從20目增加至60目，發(fā)酵時(shí)間從80 h增加至90 h，酒份均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，曲面的頂點(diǎn)即為酒份最大值。

由表2可以看出，R-sq>80%，R-sq（調(diào)整）>80%，表示所建立的模型對(duì)異變解釋能力足夠，A、B、C、D、AA、BB、CC、DD對(duì)酒份的影響具有極顯著性（P<0.05），由F值的大小可知，影響酒份的主次順序?yàn)椋篊>D>B>A，即生料酶加量>底物濃度>發(fā)酵時(shí)間>原料粒度，將酒份取最大值，軟件自動(dòng)分析得到最優(yōu)條件為：原料粒度在47.07目，底物濃度在36.56%，生料酶加量在1.2475%（w/w），發(fā)酵時(shí)間在86.11 h，此條件下，酒份能夠達(dá)到19.95%（v/v），為便于實(shí)際操作與應(yīng)用，將各個(gè)條件選取優(yōu)化為原料粒度在50目，底物濃度在37%，生料酶加量在1.25%（w/w），發(fā)酵時(shí)間在85h，酒份達(dá)到19.86%（v/v），淀粉利用率為90.25%。

3 ?結(jié) 論

利用MiniTab軟件的響應(yīng)面法，研究?jī)?yōu)化玉米生料發(fā)酵乙醇的工藝，通過分析可以得到影響因素中生料酶的加量對(duì)發(fā)酵酒份的影響最大，糖化酶添加量次之，原料粒度最小，形成的數(shù)學(xué)模型顯著性良好。通過軟件最優(yōu)解得到玉米生料發(fā)酵乙醇的最佳工藝條件為50目全玉米粉為原料，底物濃度為37%，生料預(yù)液化酶制劑0.5%（w/w），生料酶1.25%（w/w），加入酵母活化液（干酵母加量0.05%），并添加氮源尿素以及青霉素，恒溫32 ℃發(fā)酵85 h，酒份能夠達(dá)到19.86%（v/v），淀粉利用率為90.25%。

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