錢娟娟　王克芬　宋靜靜　劉勝利　王興吉　劉文龍

摘要 以枯草芽孢桿菌A-06為出發(fā)菌株，利用ARTP-亞硝基胍（NTG）復(fù)合誘變方法對該菌株進(jìn)行遺傳改造。經(jīng)過平板初篩，搖瓶復(fù)篩，最終篩選出一株酶活提高明顯、遺傳穩(wěn)定的菌株N-36。其搖瓶發(fā)酵酶活達(dá)29 500 U/mL，較出發(fā)菌株酶活提高90%左右。

關(guān)鍵詞 中性蛋白酶;ARTP;NTG;復(fù)合誘變;篩選

中圖分類號 Q933文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）21-0005-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.21.002

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Screening of High Neutral Protease Producing Strains by ARTPNTG Compound Mutagenesis

QIAN Juanjuan， WANG Kefen， SONG Jingjing et al

（Shandong Long Kete Enzyme Co.， Ltd.， Shandong Province Key Laboratory of Enzyme Preparation Fermentation Technology， Linyi， Shandong 276400）

Abstract The original strain of Bacillus subtilis A06 was modified in genetic characteristics by ARTPNTG compound mutagenesis. One high neutral proteaseyielding strain N36 was screened from the mutants by slab screening and shake flask rescreening， which the enzyme activity increased obviously and had good genetic stability. The enzyme activity of the shake flaskfermentation reached 29 500 U/mL， which was 90% higher than that of the original strain.

Key words Neutral protease;ARTP;NTG;Compound mutagenesis;Screen

基金項目 國家重點研發(fā)計劃（2017YFB0308400）。

作者簡介 錢娟娟（1983—），女，山東威海人，工程師，碩士，從事酶制劑生產(chǎn)與開發(fā)工作。通信作者，工程師，碩士，從事酶制劑生產(chǎn)與開發(fā)工作。

收稿日期 2019-05-16

中性蛋白酶主要是由微生物發(fā)酵提取而得的，可用于各種蛋白質(zhì)水解處理，水解產(chǎn)物為氨基酸、小肽等[1]。它是被最早發(fā)現(xiàn)并廣泛應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的蛋白酶制劑，可用于皮革脫毛、畜禽血液蛋白質(zhì)水解、酒和飲料的澄清以及醫(yī)藥治療等領(lǐng)域[2-5]。近年，也有應(yīng)用于多肽制備、降解棉酚、破乳等的相關(guān)研究[6-9]。相對國外酶制劑活性來說，國產(chǎn)酶制劑活性很低，而酶制劑活性的提高，關(guān)鍵需要采用合適的技術(shù)手段來選育高產(chǎn)菌種。

誘變選育具有優(yōu)良性狀的微生物菌種是發(fā)酵工業(yè)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而誘變方法的選擇是菌種選育能否成功的關(guān)鍵[10]。其方法有多種，如物理誘變、化學(xué)誘變及基因工程育種等[11-13]。新型的常壓室溫等離子體（ARTP）誘變育種技術(shù)在具有操作簡易、條件溫和的基礎(chǔ)上，可達(dá)到一次誘變便能獲得2萬個以上突變體的大庫容高效誘變[14-15]。亞硝基胍（NTG）作為一種超強(qiáng)誘變劑，是公認(rèn)效果顯著的化學(xué)超誘變劑。該研究擬采用ARTP-NTG復(fù)合誘變技術(shù)處理對數(shù)生長期的中性蛋白酶菌液，篩選酶活提高的菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 出發(fā)菌株。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），山東隆科特酶制劑有限公司菌種實驗室保藏。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備。

ARTP-IIS常壓室溫等離子體誘變系統(tǒng)（無錫思清源生物科技有限公司）;

ZXSD-A1270生化培養(yǎng)箱（上海智誠分析儀器制造有限公司）;

ZWF-B3612搖瓶機(jī)（上海智誠分析儀器制造有限公司）;

5810R離心機(jī)（德國Eppendorf公司）;

Plus384酶標(biāo)儀（美國MD公司）;

UV-1800紫外可見分光光度計（日本島津公司）。

1.1.3 試劑。

蛋白胨、酵母粉（美國BD公司）;

酵母膏、牛肉膏（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）;

葡萄糖、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鋅、瓊脂粉、酪蛋白均為分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;

玉米淀粉、豆餅粉、麩皮（市售）。

1.1.4 培養(yǎng)基。

1.1.4.1 分離篩選培養(yǎng)基。蛋白胨1.00%、牛肉膏0.5%、氯化鈉0.5%、酪蛋白1.00%、瓊脂粉2.00%，pH 7.0。

1.1.4.2 種瓶培養(yǎng)基。蛋白胨1.00%、牛肉膏0.5%、酵母膏030%、葡萄糖1.00%、氯化鈉0.2%，pH 7.0。

1.1.4.3 搖瓶培養(yǎng)基。玉米淀粉6.30%、豆餅粉2.00%、麩皮250%、Na2HPO4·12H2O 0.20%、KH2PO40.04%、ZnCl2 005%，pH 7.0。

3 結(jié)論

采用ARTP-亞硝基胍（NTG）復(fù)合誘變的方式對出發(fā)菌株枯草芽孢桿菌A-06進(jìn)行遺傳改造，經(jīng)平板篩選，搖瓶發(fā)酵

培養(yǎng)，篩選到一株遺傳穩(wěn)定性良好的突變菌株N-36，其發(fā)酵

酶活力相對于出發(fā)菌株提高90%左右。試驗結(jié)果表明，產(chǎn)中性蛋白酶的枯草芽孢桿菌通過ARTP-NTG復(fù)合誘變，其誘變效應(yīng)大大提高，該研究為選育具有優(yōu)良性狀的微生物菌種提供了依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] 劉婷，張?zhí)毂?，林元?產(chǎn)中性蛋白酶菌株的篩選及其發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（5）：102-104，107.

[2] 李泰明，徐秀蘭.AS1.398中性蛋白酶固定化條件的初步研究[J].藥物生物技術(shù)，1998，5（4）：214-218.

[3] 陳武勇，辜海兵，秦濤，等.中性蛋白酶水解鉻革屑的研究 [J].中國皮革，2001，30（21）：2-5.

[4] 唐兵，周林峰，陳向東，等.嗜熱脂肪芽孢桿菌高溫蛋白酶的產(chǎn)生條件及酶學(xué)性質(zhì)[J].微生物學(xué)報，2000，40（2）：188-192.

[5] 李永泉，朱志成，李向晨，等.中性蛋白酶發(fā)酵工藝優(yōu)化研究[J].微生物學(xué)通報，1995，22（5）：155-154.

[6] 馬淑慧，李學(xué)軍，都興范，等.脫脂柞蠶蛹蛋白用復(fù)合中性蛋白酶水解制備多肽的工藝條件優(yōu)化試驗[J].蠶業(yè)科學(xué)，2017，43（6）：991-997.

[7] 王攀，范娜.中性蛋白酶酶解核桃餅粕制備抑菌多肽的研究[J].食品工業(yè)，2018，39（9）：153-157.

[8] 亓秀曄，謝全喜，陳振，等.中性蛋白酶降解棉粕中棉酚的研究[J].中國釀造，2017，36（10）：144-148.

[9] 藍(lán)燦華，吳菲菲，鄭丹梅，等.中性蛋白酶在麥迪霉素溶媒萃取中的破乳作用[J].福建畜牧獸醫(yī)，2016，38（3）：20-23.

[10] 薛林貴，景春娥，趙旭，等.重離子誘變技術(shù)選育堿性蛋白酶高產(chǎn)菌株[J].微生物學(xué)通報，2010，37（6）：845-851.

[11] 潘明，周永進(jìn)，張強(qiáng).產(chǎn)生淀粉糖化酶菌株的誘變選育[J].釀酒科技，2006（10）：37-39.

[12] 姚婷婷，王衍敏，顧建龍，等.攜多拷貝glaA的重組黑曲霉過量合成糖化酶的研究[J].生物工程學(xué)報，2006，22（4）：567-571.

[13] 喬殿華，唐國敏，鐘麗嬋，等.黑曲霉糖化酶基因表達(dá)調(diào)控的研究I.高產(chǎn)及低產(chǎn)菌株糖化酶表達(dá)的總體分析和比較[J].微生物學(xué)報，1997，37（5）：349-354.

[14] ZONG H，ZHAN Y，LI X，et al.A new mutation breeding method for Streptomyces albulus by an atmospheric and room temperature plasma[J].African journal of microbiology research，2012，6（13）：3154-3158.

[15] ZHANG X，ZHANG X F，LI H P，et al.Atmospheric and room temperature plasma（ARTP）as? a new powerful mutagenesis tool[J].Applied microbiology and biotechnology，2014，98（12）：5387-5396.