姜佳蕾，蔣昆諭，牛慧敏，董松濤，王詩(shī)琪，孟勝男

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥劑教研室，沈陽(yáng) 110122）

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞蛋白質(zhì)合成和折疊的重要場(chǎng)所。各種生理或病理因素都能干擾蛋白質(zhì)合成過(guò)程，從而使未折疊和錯(cuò)誤折疊蛋白在腔內(nèi)聚集，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）［1-2］。ERS是慢性代謝疾病的重要標(biāo)志，也是連接免疫系統(tǒng)與代謝系統(tǒng)的橋梁［3-4］，但ERS對(duì)藥物代謝是否有影響目前尚不清楚。肝臟是最重要的代謝和解毒器官，肝細(xì)胞富含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，是ERS最為敏感的細(xì)胞之一［5］。目前，ERS對(duì)藥物Ⅰ相代謝影響的研究比較活躍［6］，但ERS對(duì)藥物Ⅱ相代謝影響的研究較少。隨著藥物代謝研究的深入和發(fā)展，藥物Ⅱ相代謝對(duì)藥物處置的重要性越來(lái)越受到重視［7］。尿苷二磷酸葡萄糖酸轉(zhuǎn)移酶（UDP-glucuronosyltransferases，UGTs）是最重要的Ⅱ相藥物代謝酶，UGTs介導(dǎo)的葡萄糖醛酸化結(jié)合反應(yīng)對(duì)藥物的生物利用度、解毒及藥物相互作用等有非常重要的作用［4，8-9］。肝臟中的UGTs表達(dá)量很高，且位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，如果機(jī)體發(fā)生ERS，可能會(huì)直接造成UGTs表達(dá)和活性的改變。白藜蘆醇具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)及類(lèi)雌激素樣活性等廣泛的藥理作用［10］，是目前新藥開(kāi)發(fā)研究中極具應(yīng)用前景和臨床價(jià)值的熱點(diǎn)化合物之一［11］。研究［12-13］顯示，白藜蘆醇的體內(nèi)外代謝模式主要是UGTs介導(dǎo)的Ⅱ相代謝，且UGT1A1及UGT1A9在其代謝中發(fā)揮重要作用。因此，本研究選擇白藜蘆醇作為模型藥物，以考察ERS對(duì)白藜蘆醇代謝的影響，并探討ERS是否對(duì)UGTs介導(dǎo)的葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)生影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物及試劑：反式-白藜蘆醇（98%，上海諾特生物科技有限公司）；毒胡蘿卜素（thapsigargin，Tg，98%，美國(guó)APExBIO公司）；蛇床子素（98%，大連美倫生物技術(shù)有限公司）；Bip抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology公司）；UGT1A1抗體、UGT1A9抗體（中國(guó)Absin公司）；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔Ig（H+L）二抗（中國(guó)ABBKIN公司）；HepG2細(xì)胞正常組裂解液及Tg誘導(dǎo)模型組裂解液（自提，1.28 mg/mL）；輔因子UDPGA、丙甲菌素（美國(guó)Sigma-Aldrich公司）；DMEM、胎牛血清、胰酶（美國(guó)Invitrogen公司）；非必需氨基酸、青-鏈霉素雙抗溶液（美國(guó)Hyclone公司）；乙腈（色譜純，天津康科德公司）；其他試劑為分析純，超純水。

1.1.2 儀器：UPLC-Waters，Waters 2996 PDA檢測(cè)器（美國(guó)Waters公司）；Aquasonic 150D超聲波儀（美國(guó)VWR Scientific公司）；凝膠成像系統(tǒng)（以色列DNR公司）。

1.2 方法

1.2.1 ERS細(xì)胞模型制備：用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)肝癌HepG2細(xì)胞（本實(shí)驗(yàn)室保存）。取對(duì)數(shù)期HepG2細(xì)胞，隨機(jī)分為正常組和模型組，模型組細(xì)胞用1 μmol/L Tg 處理24 h，誘導(dǎo)制備ERS模型，收集細(xì)胞。

1.2.2 Westem blotting檢測(cè)葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose regulated protein，GRP78）表達(dá)水平的變化：裂解HepG2野生型及誘導(dǎo)型細(xì)胞，收集蛋白。行SDSPAGE（分離膠濃度12% ），轉(zhuǎn)膜，5% 脫脂奶粉封閉1 h；分別加入GRP78、UGT1A1、UGT1A9的多克隆抗體，4℃緩慢震蕩孵育過(guò)夜；洗膜后，加入山羊抗兔二抗，室溫孵育1 h；再次洗膜后，ECL發(fā)光顯像。GAPDH作內(nèi)參照蛋白。

1.2.3 色譜：色譜柱為 CQUITY UPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×50 mm）；流動(dòng)相為乙酸銨水溶液（A）（2.5 mmol/L，pH7.4），乙腈（B）（色譜級(jí)）。采取梯度洗脫，0～0.5 min，7% B；0.5～1.5 min，7%～15% B；1.5～3.5 min，15%～50% B；3.5～4.0 min，50%～85% B；4.0～4.5 min，85%～7% B；4.5～6.0 min，7% B；進(jìn)樣量10 μL，流速0.25 mL/min，柱溫35℃，內(nèi)標(biāo)為蛇床子素。

1.2.4 樣品處理及體外孵育實(shí)驗(yàn)：

1.2.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞裂解液的制備 胰酶消化融合達(dá)90%～95%的HepG2細(xì)胞，將細(xì)胞混懸液（2×105/mL）種植于10 cm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)3 d，PBS洗3次，加入1 mL PBS后將細(xì)胞刮下，4℃ 3 000 r/min 離心8 min，在冰冷水浴中用Aquasonic 150D超聲波儀以最大功率（135平均瓦特）的短脈沖超聲處理細(xì)胞懸浮液8 min，收獲所得細(xì)胞裂解液并測(cè)定濃度。

1.2.4.2 白藜蘆醇肝細(xì)胞裂解液體外葡萄糖醛酸化代謝孵育實(shí)驗(yàn) 制終濃度分別為100、500、1 000 μmol/L的白藜蘆醇-甲醇溶液。分別取白藜蘆醇的儲(chǔ)備液，KPI緩沖溶液、UGDPA、丙甲菌素、細(xì)胞裂解酶蛋白按3∶186∶42∶53∶16混合，反應(yīng)體系總體積為200 μL，37 ℃恒溫振蕩水浴箱中孵育，根據(jù)反應(yīng)速率設(shè)定不同的孵育時(shí)間。孵育結(jié)束后立即取出置于冰浴中，加冰甲醇終止反應(yīng)，加入內(nèi)標(biāo)蛇床子素溶液50 μL，4℃、15 000 r/min離心20 min，取上清進(jìn)行色譜檢測(cè)（檢測(cè)波長(zhǎng)306 nm）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)點(diǎn)均為3次測(cè)定的平均值，以表示。2組間差異比較采用Student’st檢驗(yàn)，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ERS細(xì)胞模型的驗(yàn)證

通過(guò)Western blotting檢測(cè)ERS標(biāo)志性蛋白GRP78的表達(dá)變化，驗(yàn)證模型是否構(gòu)建成功。結(jié)果顯示，經(jīng)Tg誘導(dǎo)的模型組HepG2細(xì)胞中GRP78蛋白表達(dá)增加至正常組的7.35倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.001），證明ERS細(xì)胞模型構(gòu)建成功，見(jiàn)圖1。

圖1 Tg對(duì)HepG2細(xì)胞GRP78蛋白表達(dá)水平的影響Fig.1 The effect of Tg on the expression of GRP78 in HepG2 cells

2.2 ERS對(duì)UGT1A1和UGT1A9蛋白表達(dá)的影響

與正常組相比，模型組HepG2細(xì)胞中Ⅱ相藥物代謝酶UGT1A1、UGT1A9蛋白表達(dá)分別增高了1.96倍、1.47倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），見(jiàn)圖2。表明ERS可以上調(diào)UGT1A1、UGT1A9的蛋白表達(dá)。

2.3 ERS對(duì)白藜蘆醇葡萄糖醛酸化代謝反應(yīng)速率的影響

細(xì)胞裂解液孵育實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，白藜蘆醇在正常組HepG2中有代謝產(chǎn)物生成，而在模型組中代謝產(chǎn)物則很少（圖3）。白藜蘆醇藥物濃度為100、500、1 000 μmol/L時(shí)，正常組代謝速率分別是模型組的61.89倍、25.58倍、20.21倍，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001），見(jiàn)圖3。證實(shí)ERS可導(dǎo)致白藜蘆醇的葡萄糖醛酸化代謝顯著減弱。

3 討論

圖2 Tg對(duì)HepG2細(xì)胞UGT1A1和UGT1A9蛋白表達(dá)水平的影響Fig.2 The effect of Tg on the expression of UGT1A1 and UGT1A9 in HepG2 cells

圖3 白藜蘆醇在正常組和模型組HepG2細(xì)胞裂解液中孵育的葡萄糖醛酸化代謝速率Fig.3 Glucuronidation metabolism rate of resveratrol in wild-type HepG2 cell lysate and Tg-induced cell lysate

肝臟是機(jī)體最重要的藥物代謝器官，內(nèi)、外源性化合物（包括藥物和毒物）通過(guò)Ⅰ相和Ⅱ相代謝完成生物轉(zhuǎn)化。肝臟富含藥物Ⅰ相和Ⅱ相代謝酶，介導(dǎo)Ⅰ相和Ⅱ相代謝的2個(gè)非常重要的酶系，即細(xì)胞色素P450酶（cytochrome P450，CYP450）和UGTs均定位于肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。因此，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的正常維持對(duì)藥物代謝具有重要的生物學(xué)意義。研究［14］證明，肝損傷及疾病，如肝纖維化、病毒性肝炎、藥物性肝炎、非酒精性脂肪肝等可以影響藥物代謝酶的表達(dá)和功能，且這些損傷和疾病都會(huì)引發(fā)ERS。因此，明確ERS對(duì)藥物代謝的影響，對(duì)臨床提高藥物療效、減少藥物不良反應(yīng)、避免藥物相互作用具有重要意義，也是藥物精準(zhǔn)治療的迫切需要。

本研究重點(diǎn)探討了ERS對(duì)Ⅱ相藥物代謝酶UGTs表達(dá)和功能的影響。本研究選用了肝癌HepG2細(xì)胞，原因在于肝臟是人體內(nèi)最重要的代謝和解毒器官。由于正常人體肝臟的細(xì)胞株奇缺或難于購(gòu)買(mǎi)，故本研究選擇了目前藥物代謝研究中應(yīng)用廣泛、非?；钴S、穩(wěn)定且癌性較低的HepG2細(xì)胞。另外，研究［15］證實(shí)，HepG2細(xì)胞中有較完整的Ⅰ相和Ⅱ相代謝酶的表達(dá)，這是選擇該種細(xì)胞的另一個(gè)重要原因。

本研究?jī)H從多個(gè)UGTs亞型中選擇了UGT1A1和UGT1A9作為研究對(duì)象，是由于有多篇文獻(xiàn)［16-17］證實(shí)兩者是白藜蘆醇的主要代謝酶。本研究結(jié)果顯示，ERS可導(dǎo)致這2種主導(dǎo)代謝酶的表達(dá)發(fā)生顯著改變，并且UGTs介導(dǎo)的酶學(xué)孵育實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)白藜蘆醇代謝速率的變化趨勢(shì)與UGT1A1和 UGT1A9蛋白表達(dá)變化的趨勢(shì)一致。提示ERS條件下UGT1A1和UGT1A9仍在白藜蘆醇的代謝中發(fā)揮主要作用。后續(xù)研究將通過(guò)應(yīng)用UGT1A1或 UGT1A9抑制劑及靶基因調(diào)控實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定2種酶的具體作用機(jī)制。

目前，常用的制備ERS細(xì)胞模型的誘導(dǎo)劑有衣霉素和Tg。但由于UGT1A9的活性可受衣霉素造成的非糖基化影響而失活，而Tg沒(méi)有非糖基化效應(yīng)［18］。因此，本研究選擇Tg作為ERS模型制備的工具藥。

總之，本研究結(jié)果證實(shí)，ERS可引起UGTs介導(dǎo)的白藜蘆醇Ⅱ相代謝發(fā)生變化。今后將深入探究ERS對(duì)其他Ⅱ相代謝的影響，并綜合闡釋ERS對(duì)藥物代謝的作用。