王建筑，畢研平，李 菲，陳 瑩

［山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院） 藥學(xué)院，山東 泰安271016］

柚皮素是二氫黃酮類化合物，具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗纖維化、抗癌、抗腫瘤、抗病毒等多種藥理活性［1-6］，但該成分脂溶性和水溶性均較差，并且在家兔體內(nèi)的生物利用度以游離柚皮素計算僅為4%［7］，體內(nèi)吸收差、生物利用度低等因素使其臨床應(yīng)用受到一定限制［8］。納米給藥系統(tǒng)因其微小的粒徑和特殊的結(jié)構(gòu)而具有一系列獨特優(yōu)勢，可通過不同載體來顯著增加難溶性藥物溶解性，并提高其口服生物利用度，此外還能明顯改善釋藥特性。目前，改善柚皮素溶解度、生物利用度的方法主要有固體脂質(zhì)納米粒［9-10］、膠束［11］、納米乳［12］等。

聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）是一類可降解的共聚物，安全性高，生物相容性良好［13-14］，孫雅楠［15］等采用納米沉淀法結(jié)合脂質(zhì)體擠壓法成功制備了紅細(xì)胞膜包裹PLGA 納米粒，發(fā)現(xiàn)它具有明顯的殼-核結(jié)構(gòu)，可使藥物具有緩釋作用，而且體外毒性顯著降低。目前，制備PLGA 納米粒時需要加入適量穩(wěn)定劑以防止自我聚集，常用的有聚維酮（PVP）、聚乙烯醇（PVA）等，但這些穩(wěn)定劑難以徹底清除，而且對人體具有一定毒性。牛血清白蛋白是由疏水性氨基酸殘基和親水性氨基酸殘基構(gòu)成，作為藥物載體具有安全無毒、無免疫原性、生物相容性好等優(yōu)點，在體內(nèi)具有天然獨特的靶向性和緩釋性。在采用乳化溶劑揮發(fā)法制備PLGA 納米粒過程中，白蛋白可利用自身多個疏水性結(jié)合部位與疏水PLGA 的結(jié)合，從而起到“表面活性劑”的作用，同時在納米粒的表面利用二硫鍵作用形成交聯(lián)結(jié)構(gòu)，包裹在納米粒的表面而形成一層蛋白層［16］，此外還可選擇其作為穩(wěn)定劑增加納米粒穩(wěn)定性。

本實驗將制備載柚皮素的牛血清白蛋白修飾PLGA 納米粒，既可增加藥物溶解性，又能利用微球緩釋性來解決藥效短、頻繁給藥的問題，并對該納米粒進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征以確認(rèn)其結(jié)構(gòu)，最后探究其體外釋藥行為，為柚皮素臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料

柚皮素（含有量98%，陜西慧科植物開發(fā)有限公司）。聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）（50 ∶50，分子量30 000 Da，濟(jì)南岱罡生物工程有限公司）；牛血清白蛋白（合肥博美生物科技有限責(zé)任公司）。PC-2006高效液相色譜儀（大連依利特分析儀器有限公司）；激光粒度分析儀（英國Malvern 公司）；IR Affinity-15傅立葉變換紅外光譜儀（日本島津公司）；JY92-2D 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；超濾管（0.5 mL，3 kD，美國Millipore 公司）；透析袋（截留分子量8 000～14 000 Da）。

2 方法

2.1 納米粒制備 采用乳化溶劑揮發(fā)法制備。精密稱取4 mg 柚皮素和適量PLGA，溶于2 mL氯仿／乙醇（4 ∶1）中作為油相，在攪拌下將其緩慢滴加到8 mL 20 mg／mL 牛血清白蛋白溶液中，冰水浴探頭超聲（600 W）4 min 乳化分散，形成O／W 型納米乳，室溫下置于電磁攪拌器上繼續(xù)攪拌4 h，得到帶有藍(lán)色乳光半透明的膠體溶液，再將其置于超速冷凍離心機(jī)內(nèi)離心（18 000×g）30 min，去離子水重新分散后冷凍干燥，即得。

2.2 包封率、載藥量測定

2.2.1 色譜條件 Hypersil ODS C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相0.1% 磷酸-乙腈（55 ∶45）；體積流量1.0 mL／min；檢測波長288 nm；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

2.2.2 方法學(xué)考察 精密稱取柚皮素適量，流動相配制成2、4、8、16、32、64 μg／mL，在“2.2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，以峰面積（Y）對溶液質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行線性回歸，并測定其精密度和加樣回收率。

2.2.3 測定方法 取納米粒6 mg，加入2 mL 純水復(fù)溶，取0.4 mL 置于超濾管中，3 000×g離心10 min，取100 μL 超濾液加900 μL 甲醇適當(dāng)稀釋，HPLC 法測定未被PLGA 包封的藥量。另取復(fù)溶后PLGA 納米?；鞈乙?00 μL，加900 μL 乙腈溶解破壞納米粒渦 旋 30 s，超 聲 5 min，15 000 r／min高速冷凍離心10 min 沉淀蛋白，取上清液，HPLC 法測定柚皮素總藥量。取適量混懸液進(jìn)行冷凍干燥，稱定凍干品質(zhì)量，按下式計算包封率、載藥量。

包封率=［（m總-m包）／m總］×100%，載藥量=［（m總-m包）／m］×100%。其中，m包為納米粒中包裹藥物量，m總為總藥量，m為納米?？傎|(zhì)量。

2.2.4 粒徑、PDI 測定及形態(tài)觀察 將復(fù)溶后的納米粒用純水適當(dāng)稀釋后，馬爾文激光粒度分析儀測定其粒徑和PDI。再取適量滴在銅網(wǎng)上，純水清洗，自然晾干后2%磷鉬酸鈉溶液負(fù)染，晾干后置于透射電鏡（TEM）下觀察納米粒形態(tài)大小，并進(jìn)行拍照。

2.2.5 穩(wěn)定性考察 納米粒凍干樣品中加入純水和磷酸鹽緩沖液（pH=7.4）復(fù)溶，并稀釋至制備時的濃度，冰箱冷藏室（4 ℃）中放置14 d，觀察其粒徑、PDI、包封率變化。

2.2.6 體外釋放行為 取納米粒凍干粉加純水復(fù)溶、柚皮素乙醇溶液各約2 mL（均含柚皮素約1 mg）加到處理好的透析袋中，兩端扎緊，將其完全浸沒到37 ℃100 mL 體外釋放液［含0.5%吐溫-80的磷酸鹽緩沖液（pH=7.4）］中攪拌（100 r／min），于0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、10、12、24 h 各取樣1 mL，并補(bǔ)充新鮮釋放介質(zhì)，微孔濾膜過濾，HPLC 法測定柚皮素含有量，計算累積釋放度。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)考察 柚皮素回歸方程為Y=48.39X＋2.38（r=0.999 3），在2～64 μg／mL 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，而且該方法精密度（RSD＜3%）和平均加樣回收率（97%～103%，RSD＜5%）均符合相關(guān)要求。

3.2 制備工藝優(yōu)化

3.2.1 超聲功率 選擇15 mg／mL 牛血清白蛋白溶液8 mL 作為水相，25 mg PLGA（50 ∶50）溶于2 mL 氯仿／乙醇（4 ∶1）中作為油相，超聲時間4 min，考察超聲功率400、500、600、700 W，結(jié)果見表1。由表可知，隨著超聲功率增加粒徑、PDI 呈減小趨勢，但變化不明顯，故選擇600 W 作為超聲功率。

3.2.2 超聲時間 選擇“3.2.1”項下水相和油相，超聲功率600 W，考察超聲時間3、4、5、6 min，結(jié)果見表2。由表可知，超聲時間4 min 后粒徑、PDI 基本穩(wěn)定，故選擇4 min 作為超聲時間。

表1 超聲功率對粒徑、PDI 的影響（n=3）Tab.1 Effects of ultrasonic power on particle size and PDI（n=3）

表2 超聲時間對粒徑、PDI 的影響（n=3）Tab.2 Effects of ultrasonic time on particle size and PDI（n=3）

3.2.3 牛血清白蛋白質(zhì)量濃度 選擇“3.2.1”項下油相，水相體積8 mL，超聲功率600 W，超聲時間4 min，考察牛血清白蛋白質(zhì)量濃度10、15、20、25 mg／mL，結(jié)果見表3。由表可知，牛血清白蛋白質(zhì)量濃度對粒徑、包封率影響較大，可能是由于它作為表面活性劑，在油水兩相乳化時會影響納米乳形成，從而影響納米粒質(zhì)量，故選擇20 mg／mL 作為牛血清白蛋白質(zhì)量濃度。

表3 牛血清白蛋白質(zhì)量濃度對粒徑、PDI、包封率、載藥量的影響（n=3）Tab.3 Effects of bovine serum albumin concentration on particle size，PDI，encapsulation efficiency and drug loading（n=3）

3.2.4 PLGA 質(zhì)量濃度 選擇“3.2.1”項下水相，PLGA 溶于溶于氯仿／乙醇（4 ∶1）中作為油相，超聲功率600 W，超聲時間4 min，考察PLGA質(zhì)量濃度50、25、12.5、6.25 mg／mL，結(jié)果見表4。由表可知，低質(zhì)量濃度（6.25 mg／mL）時粒徑、包封率明顯小于其他質(zhì)量濃度；高質(zhì)量濃度（25、50 mg／mL）時粒徑明顯大于中質(zhì)量濃度（12.5 mg／mL），但包封率無明顯變化，故選擇12.5 mg／mL 作為PLGA 質(zhì)量濃度。

3.2.5 油水相比例 選擇20 mg／mL 牛血清白蛋白溶液作為水相，PLGA（50 ∶50）溶于2 mL 氯仿／乙醇（4 ∶1）中作為油相，超聲功率600 W，超聲時間3 min，考察油水相比例2 ∶5、2 ∶8、2 ∶11、2 ∶14，結(jié)果見表5。由表可知，當(dāng)油水相比例超過2 ∶8時，粒徑明顯變小，而包封率在該比例時最高，故選擇2 ∶8作為油水相比例。

表4 PLGA 質(zhì)量濃度對粒徑、PDI、包封率、載藥量的影響（n=3）Tab.4 Effects of PLGA concentration on particle size，PDI，encapsulation efficiency and drug loading（n=3）

表5 油水相比例對粒徑、PDI、包封率、載藥量的影響（n=3）Tab.5 Effects of oil-water phase ratio on particle size，PDI，encapsulation efficiency and drug loading（n=3）

3.2.6 投藥量 選擇選擇“3.2.1”項下水相和油相，油水相比例8 ∶2，超聲功率600 W，超聲時間4 min，考察投藥量4、5、6、7 mg，結(jié)果見表6。由表可知，投藥量4、5 mg 時，粒徑小而均勻，包封率高；6 mg 時，包封率明顯下降；7 mg時，納米粒出現(xiàn)明顯的渾濁，離心后通過偏光顯微鏡發(fā)現(xiàn)它是由藥物結(jié)晶造成的，故選擇5 mg 作為投藥量。

表6 投藥量對粒徑、PDI、包封率、載藥量的影響（n=3）Tab.6 Effects of drug-fed consumption on particle size，PDI，encapsulation efficiency and drug loading（n=3）

3.3 粒徑、形態(tài) 納米粒粒徑為（98.3±2.34）nm，PDI 為（0.149±0.012）。圖1顯示，納米粒呈球形，具有明顯的核-殼結(jié)構(gòu)，形態(tài)規(guī)整，大小均勻，之間無粘連，粒徑約為100 nm 左右。

3.4 穩(wěn)定性 表7顯示，無論是在純水還是在磷酸鹽緩沖液（pH=7.4）中，納米粒粒徑、包封率均未發(fā)生明顯變化，表明其穩(wěn)定性良好。

圖1 納米粒TEM 圖Fig.1 TEM images for nanoparticles

表7 納米粒穩(wěn)定性考察結(jié)果Tab.7 Results of stability investigation of nanoparticles

3.5 體外釋放行為 圖2顯示，原料藥能順利通過透析袋，在6 h 時已釋放完全；納米粒釋藥初期附著于其表面的藥物快速釋放，形成輕微突釋效應(yīng)，而后期釋藥平緩，在24 h 時累積釋放度約為80%，呈現(xiàn)出明顯的緩釋效應(yīng)。

圖2 樣品體外釋藥曲線Fig.2 In vitro drug release curves for samples

3.6 紅外測定 將柚皮素、牛血清白蛋白、PLGA、納米粒分別與溴化鉀混合研磨后，通過紅外可見分光光度計測定，結(jié)果見圖3。由圖可知，納米粒在～1 300 cm-1處鈍而弱的峰可能為N-H，～1 600 cm-1處銳而強(qiáng)的峰可能為C=O，1 500～1 400 cm-1處吸收強(qiáng)度比較小的尖峰可能為C=N；牛血清白蛋白吸收峰和納米?；鞠嗨?；PLGA 在～2 900 cm-1處2個尖峰可能是乳酸中C-H，～1 700 cm-1處1個強(qiáng)峰可能為C=O，～1 400 cm-1處尖峰可能為-OH；柚皮素雜峰比較多，在1 629 cm-1處出現(xiàn)明顯尖峰，吸收強(qiáng)度較強(qiáng)，可能為苯環(huán)特征峰，～1 600 cm-1處最強(qiáng)尖峰為C=O，～1 100 cm-1處1個吸收峰初步判斷為C-O-C，3 200～3 000 cm-1處扁平峰為羥基。另外，通過峰形可觀察到納米粒與牛血清白蛋白的峰比較接近，表明在前者外層吸附著1層白蛋白。

圖3 樣品紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectra for samples

4 討論及結(jié)論

乳化溶劑揮發(fā)法可分為兩步，探頭超聲乳化制備初乳，以及攪拌下?lián)]發(fā)有機(jī)溶劑，水油兩相超聲后形成納米乳，由于溶劑揮發(fā)后納米粒逐漸形成，故超聲乳化過程對納米粒形成及粒徑、包封率的影響很大。超聲過程中不斷增加功率、延長時間并不能明顯減少納米粒粒徑，其原因可能是達(dá)到一定功率和時間后會降低油水兩相的表面張力，并使之達(dá)到平衡，形成納米乳，故不需無限制增加兩者。

牛血清白蛋白質(zhì)量濃度為10、15 mg／mL 時，樣品均在1 d 后出現(xiàn)沉淀，表明質(zhì)量濃度過低不能起到穩(wěn)定納米粒膠體體系的作用；質(zhì)量濃度足夠，蛋白充分包圍在納米粒表面，使其均勻分散在懸浮液中；質(zhì)量濃度過高，會導(dǎo)致納米乳體系黏度過大，影響超聲乳化效果。因此，確定牛血清白蛋白質(zhì)量濃度為20 mg／mL。

當(dāng)水相體積為5 mL 時，納米混懸液于48 h 后出現(xiàn)沉淀，表明水相體積不能過小，其原因可能為油水相混合后超聲時可形成水包油（O／W）乳劑，若水相體積減小，有機(jī)相形成的微小乳滴就不能較好地分散在水相中，而且水相減少可導(dǎo)致乳滴之間融合趨勢增加，溶劑揮去后納米粒容易形成沉淀。

白蛋白載藥體系在延長載體體內(nèi)循環(huán)時間、提高藥物穩(wěn)定性和藥效等方面具有其他傳統(tǒng)藥物載體不可比擬的優(yōu)勢，相較單純白蛋白載藥，白蛋白-PLGA 納米粒復(fù)合型載藥體系可實現(xiàn)更多功能，如體內(nèi)腫瘤靶向性等。本實驗制備了載柚皮素的牛血清白蛋白修飾PLGA 納米粒，并初步探究其優(yōu)化工藝、結(jié)構(gòu)表征、體外釋放等，可為后期進(jìn)一步體內(nèi)研究奠定基礎(chǔ)。