李云峰（通訊作者） 楊丕波 王瑾

（1 湖北省第三人民醫(yī)院＜湖北省中山醫(yī)院〉口腔科 湖北 武漢 430033）

（2 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院口腔科 湖北 武漢 430030）

口腔鱗癌的發(fā)病機(jī)制被越來(lái)越多的研究證實(shí)與表觀遺傳學(xué)中的基因甲基化異常有關(guān)，可用于口腔鱗癌的病情及預(yù)后評(píng)估，可能較傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)水平的腫瘤標(biāo)志物具有更高的靈敏度及特異性[1,2]。Ras相關(guān)區(qū)域家族1A（RASSF1A）為調(diào)控細(xì)胞周期的抑癌基因，其甲基化異常被多個(gè)研究證實(shí)與多種惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[3,4]，但在口腔鱗癌方面尚無(wú)相關(guān)研究。本研究檢測(cè)口腔鱗癌患者口腔脫落細(xì)胞RASSF1A基因甲基化，研究其在口腔鱗癌病情及預(yù)后評(píng)估中的價(jià)值。

1.資料與方法

1.1 臨床資料

研究對(duì)象為2015年1月-2019年1月診治的口腔鱗狀細(xì)胞癌患者（鱗癌組），納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）口腔檢查、顱腦磁共振和口腔活檢或術(shù)后病理組織學(xué)確診；（2）首次診治，既往無(wú)口腔鱗癌病史及未行手術(shù)、放療及化療治療史；（3）無(wú)合并其他腫瘤性疾??；（4）知情并同意本研究。鱗癌組患者共納入80例研究對(duì)象。另選擇同期門(mén)診行口腔體檢的正常健康人為對(duì)照（對(duì)照組）。鱗癌組和對(duì)照組研究對(duì)象在性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)及吸煙史方面均具有可比性，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

表1 鱗癌組和對(duì)照組研究對(duì)象基本資料比較

1.2 RASSF1A基因甲基化檢測(cè)

鱗癌組和對(duì)照組研究對(duì)象均采用細(xì)胞刷刷取口腔脫落細(xì)胞，鱗癌組取材部位為病變處。提取口腔脫落細(xì)胞基因組總DNA后采用基因甲基化特異性PCR法檢測(cè)RASSF1A基因甲基化，采用Methprimer 2.0設(shè)計(jì)引物，引物序列見(jiàn)表2，反應(yīng)體系為50μL，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，65℃退火30s，72℃延伸10min，共30個(gè)循環(huán)，最后一個(gè)循環(huán)72℃延伸6min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后顯色判斷結(jié)果（根據(jù)M和U擴(kuò)增條帶判斷，結(jié)果為甲基化和未甲基化），見(jiàn)表2。

表2 甲基化特異性PCR法檢測(cè)RASSF1A甲基化引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用率（%）表示，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用（）表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 RASSF1A甲基化比較

鱗癌組口腔鱗癌患者中檢測(cè)出RASSF1A甲基化56例，RASSF1A甲基化率為70.0%，對(duì)照組正常健康人中檢測(cè)出RASSF1A基因甲基化2例，RASSF1A甲基化率為2.5%，鱗癌組患者RASSF1A甲基化率顯著高于對(duì)照組（P＜0.001）。

2.2 RASSF1A甲基化與臨床病理因素的關(guān)系

本組80例口腔鱗癌患者RASSF1A甲基化率在性別、年齡和病灶部位中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），在吸煙史、分化程度、腫瘤最大徑和TNM分期中的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），有吸煙史、分化程度低、腫瘤最大徑≥3cm和Ⅲ+Ⅳ患者RASSF1A甲基化率顯著無(wú)吸煙史、中＋高分化程度、腫瘤最大徑＜3cm和Ⅰ+Ⅱ患者，見(jiàn)表3。

表3 口腔鱗癌不同臨床病理因素RASSF1A甲基化的差異

3.討論

口腔鱗癌的發(fā)病機(jī)制與基因突變和表觀遺傳學(xué)改變有關(guān)，其中表觀遺傳學(xué)是新近發(fā)現(xiàn)的與DNA堿基序列突變無(wú)關(guān)的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，而基因甲基化修飾是表觀遺傳學(xué)最常見(jiàn)的調(diào)控機(jī)制[5]。研究表明，基因啟動(dòng)子區(qū)域CG甲基化修飾后，甲基化CG自身或結(jié)合甲基結(jié)合蛋白后可阻遏轉(zhuǎn)錄因子與結(jié)合，從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄前調(diào)控作用，基因異常甲基化可用于腫瘤的病情及預(yù)后評(píng)估[6]。RASSF1A為調(diào)控細(xì)胞周期的抑癌基因，其甲基化異常與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)[7,8]。本研究中，采用甲基化特異性PCR檢測(cè)口腔鱗癌患者口腔脫落細(xì)胞RASSF1A基因甲基化，發(fā)現(xiàn)其RASSF1A基因甲基化率顯著高于對(duì)照組正常健康人，表明RASSF1A基因甲基化可能與口腔鱗癌的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。

越來(lái)越多的研究證實(shí)表觀遺傳學(xué)的基因甲基化可用于口腔癌的病情及預(yù)后評(píng)估，與傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物相比具有更高的特異性及靈敏度[9,10]。本研究比較口腔鱗癌患者口腔脫落細(xì)胞RASSF1A甲基化在不同臨床病理因素中的差異，發(fā)現(xiàn)RASSF1A基因甲基化率在性別、年齡和病灶部位中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），在吸煙史、分化程度、腫瘤最大徑和TNM分期中的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），有吸煙史、分化程度低、腫瘤最大徑≥3cm和Ⅲ+Ⅳ患者RASSF1A基因甲基化率顯著高無(wú)吸煙史、中＋高分化程度、腫瘤最大徑＜3cm和Ⅰ+Ⅱ患者，這些證據(jù)表明口腔脫落細(xì)胞RASSF1A基因甲基化可作為口腔鱗癌病情嚴(yán)重及預(yù)后評(píng)估的基因水平標(biāo)志物，與術(shù)后切除標(biāo)本檢測(cè)相比，口腔脫落細(xì)胞的檢測(cè)可在術(shù)前為口腔鱗癌的病情及預(yù)后評(píng)估提供客觀證據(jù)，更具有臨床價(jià)值。

綜上所述，RASSF1A基因在口腔鱗癌中呈甲基化狀態(tài)，與吸煙史、分化程度、腫瘤最大徑和TNM分期密切相關(guān)，在口腔鱗癌病情及預(yù)后評(píng)估中具有重要臨床價(jià)值。