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        基于核酸檢測的蝦過敏源標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究

        2019-11-18 05:44:54李春高運(yùn)華王治棟黃文勝
        中國測試 2019年9期
        關(guān)鍵詞:過敏源

        李春 高運(yùn)華 王治棟 黃文勝

        摘要:選擇最常食用的海產(chǎn)對蝦作為蝦過敏源標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的候選物,提取并純化其基因組DNA,采用序列測定法對設(shè)定的目標(biāo)基因成分進(jìn)行定性鑒定。用數(shù)字PCR技術(shù)精確確定海蝦16S基因、蝦真核生物18S基因、胡蘿卜真核生物18S基因的拷貝數(shù),以胡蘿卜基因組DNA為本底,重量法配置蝦16S基因拷貝數(shù)滇核生物18S基因組拷貝數(shù)比值為1%。評定蝦16S基因拷貝數(shù)/真核生物18S基因拷貝數(shù)比值的定值不確定度,擴(kuò)展不確定度為0.09%。并利用數(shù)字PCR儀對配置的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行特性量值驗(yàn)證,結(jié)果一致性良好。可為基于核酸檢測的食物過敏源標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制提供方法參考。

        關(guān)鍵詞:核酸檢測;蝦;過敏源;標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

        中圖分類號:TS207;Q52 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號:1674-5124(2019)09-0049-05

        收稿日期:2019-02-15;收到修改稿日期:2019-03-31

        基金項(xiàng)目:國家質(zhì)量研發(fā)重點(diǎn)專項(xiàng)項(xiàng)目(2017YFF0204604);國家質(zhì)檢公益行業(yè)科研專項(xiàng)(201510026);標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)平臺項(xiàng)目(32-APT1802-12)

        作者簡介:李春(1994-),男,安徽長豐縣人,碩士研究生,專業(yè)方向?yàn)楹怂岫糠治觥?/p>

        通信作者:高運(yùn)華(1972-),男,山東菏澤市人,副研究員,主要從事核酸計(jì)量技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)研究工作。

        0 引言

        為有效預(yù)防和控制食物過敏給人類健康帶來的危害,食物過敏源的檢測、診斷以及治療已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[1-3]。檢測過敏源成分的方法主要有兩類,一是檢測過敏源蛋白質(zhì),二是檢測過敏源基因殘留[4-6]。檢測過敏源蛋白質(zhì)方法直接,但是當(dāng)過敏蛋白含量極低時(shí),很容易被食品的基質(zhì)所掩蓋,同時(shí)不同過敏源之間有部分相同的抗原決定簇會發(fā)生一定的交叉反應(yīng),容易造成檢測的誤差[7-8]。檢測過敏源基因殘留方法并不直接針對食品中的過敏源進(jìn)行檢測,而是通過分析食品中是否還有該過敏源物種的基因成分,從而推測該產(chǎn)品是否含有該物種的過敏源[9-12]。我國發(fā)布過系列過敏源PCR檢測方法標(biāo)準(zhǔn),該標(biāo)準(zhǔn)方法基于擴(kuò)增反應(yīng),靈敏度非常高,痕量的物種殘留即可檢出,為基于基因殘留檢測的過敏源檢測提供了方法標(biāo)準(zhǔn)[13-14]。但是,非常高的靈敏度,也使PCR檢測方法在某些產(chǎn)品上會出現(xiàn)假陽性,如大豆油作為大豆的油脂一般不含有大豆蛋白過敏源,但PCR方法也可以檢測出大豆基因的物種殘留,給出陽性判定。因此,檢測過敏源蛋白質(zhì)和檢測過敏源基因殘留兩種方法均有局限性,而法定的、具有特定量值的過敏源標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是過敏源成分檢測結(jié)果準(zhǔn)確有效保證。

        食物過敏標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是解決食物過敏檢測問題的關(guān)鍵材料之一。美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院(NIST)研制了8種過敏性食物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì);歐盟資助的EuroPrevall項(xiàng)目構(gòu)建了一個(gè)食物過敏源信息的數(shù)據(jù)庫,而CREATE項(xiàng)目則首次證實(shí)重組花粉過敏源rBet v1可作為天然花粉過敏源Bet v1的候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),為開發(fā)重組食物過敏源標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)提供了一種借鑒。國內(nèi)外基于過敏源殘留基因檢測的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)方法越來越多,但相對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)現(xiàn)在還不多,世界各國正積極研制相對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。我國食物過敏源蛋白和核酸檢測的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究正積極開展,食物過敏源標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)將為我國食物過敏源蛋白和核酸檢測結(jié)果的有效性、法制性和溯源性提供強(qiáng)有力的物質(zhì)和技術(shù)支撐。本文以最常食用的蝦為候選物,以胡蘿卜為本底,用數(shù)字PCR方法測定蝦和葫蘆卜特異基因拷貝數(shù),重量法配制1%水平的蝦一胡蘿卜基因組標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),利用數(shù)字PCR和熒光定量PCR方法對配制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性量值進(jìn)行了驗(yàn)證,為基于核酸檢測的食物過敏源標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制提供參考。

        1 實(shí)驗(yàn)部分

        1.1 儀器設(shè)備

        冷凍干燥儀:熱電,Biosafer-18D,(美國);數(shù)字PCR儀:Bio-Rad QX 200(美國);實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀:LightCycler 480Ⅱ(美國);電子天平:梅特勒XSE 205DU(瑞士):超速冷凍離心機(jī):Sigma3K30(德國);超純水系統(tǒng):Milliber Q S(美國)。

        1.2 材料試劑

        基因組DNA提取試劑盒:天根生化DP323中國);動物組織基因組DNA提取試劑盒:天根生化DP324(中國):PCR擴(kuò)增試劑盒:ABI4369016(美國);數(shù)字PCR擴(kuò)增試劑:Bio-Rad(美國);數(shù)字PCR擴(kuò)增試劑:Fluidigm Biomark qdPCR 37KTMIFC(美國);甲醇(色譜純)、乙醇(分析純)、氫氧化鈉(分析純)。

        1.3 基因組DNA提取及純度分析

        采用商業(yè)化提取試劑盒的技術(shù)方案提取基因組DNA,采用紫外分光光度法對基因組DNA含量(OD260吸收值)和DNA純度(OD260/OD280比值)進(jìn)行了檢測;另外,利用瓊脂糖凝膠電泳方法對基因組DNA的完成性和相對含量進(jìn)行了檢測。

        1.4 數(shù)字PCR方法

        通過文獻(xiàn)及國家現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的比較分析[13-14],優(yōu)化建立了蝦過敏源標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的PCR擴(kuò)增條件和引物探針體系,用優(yōu)化建立的數(shù)字PCR擴(kuò)增條件和反應(yīng)體系對蝦基因組DNA中目標(biāo)基因片段,蝦和胡蘿卜基因組DNA中真核基因片段進(jìn)行了定量擴(kuò)增,用于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性量值的確定、均勻性檢驗(yàn)、穩(wěn)定性考察。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 基因組提取DNA純化分析

        以商品化的基因組DNA提取試劑盒為基礎(chǔ),提取蝦和胡蘿卜的基因組DNA,利用紫外分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳法對純化后的基因組DNA進(jìn)行了純度分析,結(jié)果見表1和圖1。

        由表1可知,純化后的基因組DNA OD260/OD280介于1.8~2.0之間,樣本純度較高;由朗伯比爾定律可知,DNA濃度與OD260紫外吸收值成正比,OD260吸收值1對應(yīng)于雙鏈DNA50ng/μL。提取的基因組DNA用數(shù)字PCR進(jìn)行檢驗(yàn),沒有抑制效應(yīng),可以用于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值分析。

        分析圖1可知,提取的基因組DNA純度較高,蛋白質(zhì)和RNA殘留較少,滿足了定量PCR和數(shù)字PCR檢測的需要,可用于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值分析。

        2.2 目標(biāo)基因擴(kuò)增條件

        通過文獻(xiàn)及國家現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的比較分析最終確定了蝦過敏源標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的PCR擴(kuò)增條件和引物探針體系[13-14],PCR擴(kuò)增熱循環(huán)條件:50℃ 2min;95℃變性、UNG酶失活10min;95℃變性15s,60℃退火延伸1min,50個(gè)循環(huán)。引榭朵針體系見表2,PCR反應(yīng)體系為TaqMan Universal PCR Master Mix(2×)10μL;引物400nmol/L,1μL:探針400nmol/L,1μL:去離子水6μL;DNA模板2μL;總反應(yīng)體系20μL。

        引物探針的特異性和靈敏度良好,熱循環(huán)條件合適,可以有效擴(kuò)增出目標(biāo)基因條帶。該反應(yīng)條件可用于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性量值的定值確定和均勻性檢驗(yàn)、穩(wěn)定性考察。

        2.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性檢驗(yàn)

        均勻性是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的固有特性之一,即在規(guī)定的細(xì)分范圍內(nèi)其特性保持不變。按照國家計(jì)量技術(shù)規(guī)范JJF1343-2012《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計(jì)學(xué)原理》中對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性評估的技術(shù)要求,隨機(jī)抽取15個(gè)包裝單元,用數(shù)字PCR方法檢測目標(biāo)基因的拷貝數(shù)濃度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性檢驗(yàn)。采用F檢驗(yàn)法對均勻性測量數(shù)據(jù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn),結(jié)果見表3。由表可知研制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品均勻一致,符合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制均勻性的要求。

        2.4 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性考察

        標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性是指在規(guī)定的時(shí)間間隔和環(huán)境條件下,標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性量值保持在規(guī)定范圍內(nèi)的性質(zhì)。過敏源標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性檢驗(yàn)采用數(shù)字PCR方法進(jìn)行測定。依據(jù)JJF1343-2012推薦的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性評價(jià)方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性檢驗(yàn)及評價(jià),檢驗(yàn)結(jié)果見表4,分析可知在12個(gè)月時(shí)間內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性量值無顯著性變化,符合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性要求,檢驗(yàn)結(jié)果為穩(wěn)定。

        2.5 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值

        基因組DNA采用本文建立的數(shù)字PCR方法進(jìn)行目標(biāo)基因拷貝數(shù)的絕對定量檢測,確定了蝦16S基因和真核生物18S基因,葫蘆卜真核生物18S基因的拷貝數(shù)。依據(jù)JJF1343-2012的要求和ISO導(dǎo)則34的要求,采用重量法配制過敏源基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),確定的標(biāo)準(zhǔn)值為拷貝數(shù)百分比值,為1%蝦16S滇核生物185=1%。

        2.6 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值不確定度分析

        定值結(jié)果不確定度主要從目標(biāo)基因拷貝數(shù)數(shù)字PCR定量、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的重量法配制、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不均勻性、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不穩(wěn)定性等部分進(jìn)行了考察。具體考察分析的不確定度來源魚骨刺圖見圖2。

        2.6.1 不確定度的量化

        目標(biāo)基因拷貝數(shù)數(shù)字PCR測量不確定度(UM)主要包括數(shù)字PCR校準(zhǔn)、儀器穩(wěn)定性、測量重復(fù)性3部分。儀器校準(zhǔn)由校準(zhǔn)證書得到,將其轉(zhuǎn)化為相對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不確定度計(jì)人標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性量值的不確定度,儀器的穩(wěn)定性和測量重復(fù)性由多次測量結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)重量法配制和樣品的稀釋配制產(chǎn)生的不確定度(uB)主要體現(xiàn)在天平稱量方面,主要包含天平本身的不確定度和多次稱量重復(fù)性兩部分。不均勻性帶來的不確定度(uH)和不穩(wěn)定性帶來的不確定度(uT)根據(jù)ISO導(dǎo)則35規(guī)定的計(jì)算方法進(jìn)行計(jì)算。具體的量化結(jié)果見表5。

        2.6.2 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

        以上不確定度分量互不相關(guān),則合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

        蝦過敏源標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:u蝦16S/真核18S=4.3%。

        2.7 定值結(jié)果

        定值結(jié)果表示為:標(biāo)準(zhǔn)值士擴(kuò)展不確定度。取包含因子k=2,則擴(kuò)展不確定度可以表示為U=k×u。蝦過敏源定值結(jié)果為1.01%±0.09%。

        3 數(shù)字PCR驗(yàn)證

        將研制好的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用數(shù)字PCR方法進(jìn)行了特性量值驗(yàn)證,結(jié)果列于表6。

        由表中數(shù)據(jù)可知,數(shù)字PCR的測量值與重量法配制值能夠很好的符合,由此說明,數(shù)字PCR進(jìn)行目標(biāo)基因拷貝數(shù)的精確定量,然后根據(jù)需要采用重量法配制成需要的不同目標(biāo)基因比值的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是可行的。由于數(shù)字PCR方法是不依賴于外標(biāo)準(zhǔn)的絕對定量方法,現(xiàn)在越來越多的應(yīng)用到目標(biāo)基因的定量分析中,也逐漸成為基于目標(biāo)基因定量的核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)權(quán)威定量方法;而重量法可以很好的實(shí)現(xiàn)設(shè)定基因比率樣本的配制,且選擇精度良好的天平可以有效減少重量法配制給標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性量值帶來的不確定度影響;因此,數(shù)字PCR和重量法結(jié)合很好的實(shí)現(xiàn)了不同物種間不同目標(biāo)基因檢測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性量值的確定,且準(zhǔn)確度較高。

        4 結(jié)束語

        針對過敏源檢測急需的目標(biāo)基因檢測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稀缺問題,本文研究建立了基于數(shù)字PCR技術(shù)的目標(biāo)基因拷貝數(shù)濃度確定方法,測定了蝦16S基因和真核生物18S基因,葫蘆卜真核生物18s基因的拷貝數(shù),然后利用重量法配制了蝦16S基因/真核生物18S基因DNA配比標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì);評定了定值結(jié)果的不確定度,為基于目標(biāo)基因檢測的過敏源標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制提供了方法借鑒。

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        (編輯:莫婕)

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