宋 芳 楊美霞 賀 帥 黃世琪 郝 奮

包頭醫(yī)學院生殖醫(yī)學研究所(014040)

Toll樣受體4(TLR4)屬于I型跨膜蛋白，是天然免疫系統(tǒng)中的一類重要模式識別受體，在調(diào)節(jié)炎癥及免疫反應(yīng)中起重要作用，可能參與自然流產(chǎn)的發(fā)生[1-3]。筆者前期研究亦發(fā)現(xiàn)，早期自然流產(chǎn)患者絨毛滋養(yǎng)層細胞和蛻膜細胞中TLR4表達均明顯高于正常妊娠婦女，說明母-胎界面TLR4異常表達是導致妊娠失敗的原因之一[4]。由此推測，在“著床窗”開放時，TLR4可能影響母-胎界面細胞生物學行為，但目前尚未見報道。因此，本實驗利用小鼠胚泡與人蛻膜細胞共培養(yǎng)著床模型[5]，觀察TLR4對胚泡滋養(yǎng)層細胞在母體蛻膜細胞上粘附和鋪展的影響，揭示TLR4對胚胎著床的影響及作用環(huán)節(jié)，為臨床治療不孕癥提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 組織來源

①蛻膜組織：來源于包頭醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科妊娠5～6周的人工流產(chǎn)婦女，平均年齡30歲，月經(jīng)周期正常，3個月內(nèi)未用任何激素類藥物。②實驗動物：選用成年昆明種遠交系小鼠(中國科學院動物研究所，7～9周齡，25～35g)，動情期雌鼠與雄鼠2∶1合籠，次日晨發(fā)現(xiàn)陰栓者為妊娠1d，于妊娠4d用頸椎脫臼法處死雌鼠，迅速剪開腹腔，在解剖鏡下用PBS緩沖液沖洗雙側(cè)子宮角，收集胚泡，按照參考文獻[6]的方法制備胚泡石蠟切片；同時將子宮用Bouin液固定，常規(guī)石蠟包埋制備組織切片。

1.2 主要試劑

小鼠抗人TLR4單克隆抗體為Santa Cruz公司產(chǎn)品，SP試劑盒購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，DAB顯色試劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。胎牛血清(FCS)和小牛血清白蛋白(BSA)為Hyclone公司產(chǎn)品。

1.3 免疫組織化學染色(SP法)

切片常規(guī)脫蠟水化，滴加過氧化物酶阻斷溶液(試劑A)，室溫孵育30min；滴加正常非免疫動物血清(試劑B)封閉30min；滴加小鼠抗人TLR4抗體(1:200)， 4℃過夜；滴加生物素標記的第二抗體(試劑C)，室溫孵育15min；滴加鏈霉素抗生物素-過氧化物酶溶液(試劑D)，室溫孵育15min。DAB-H2O2室溫顯色，Mayer蘇木精復染細胞核，脫水、透明、封片。陰性對照用PBS代替一抗，其余步驟同上。

1.4 人子宮蛻膜細胞的分離、純化與鑒定

取人工流產(chǎn)蛻膜組織，按照參考文獻[4]的方法分離純化蛻膜細胞，以5×105個/ml密度接種于50ml細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細胞爬片用小鼠抗人波形蛋白抗體(1:100)檢測純度。

1.5 小鼠胚泡與人蛻膜細胞共培養(yǎng)

將消化重懸的蛻膜細胞以1×106個/ml密度加入到含15%FCS-199的培養(yǎng)皿中，待細胞增殖生長成層后，換用0.4%BSA-199培養(yǎng)，每皿中移入5～10個胚泡，在倒置顯微鏡下觀察胚泡的粘附和鋪展情況。取共培養(yǎng)72h細胞爬片，制備掃描電鏡標本，觀察小鼠滋養(yǎng)層細胞與人蛻膜細胞生長情況。

1.6 胚泡滋養(yǎng)層細胞的粘附與鋪展

待細胞生長匯合成層后，實驗組分別換用經(jīng)0.4%BSA-199稀釋的不同濃度(100、200、400ng/ml)抗TLR4抗體，對照組用無抗體的0.4%BSA-199進行培養(yǎng)。每皿移入15～20個胚泡，分別于培養(yǎng)24h、48、72h時在倒置顯微鏡下觀察并記錄胚泡的粘附和鋪展情況?？焖佥p晃培養(yǎng)皿，胚泡不移動者為粘附；已粘附的胚泡滋養(yǎng)層細胞外延生長≥80μm者為鋪展。分別于共培養(yǎng)24、48h統(tǒng)計粘附率和鋪展率，于共培養(yǎng)72h用顯微鏡目測柵測量并計算鋪展面積。相同實驗至少重復3次，每組觀察35～40個胚泡。

1.7 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 著床前小鼠胚泡和子宮內(nèi)膜中TLR4蛋白表達

TLR4蛋白在小鼠胚泡的內(nèi)細胞群和滋養(yǎng)層細胞的胞質(zhì)內(nèi)均有陽性表達，呈棕黃色(圖1A、B、C)。TLR4在妊娠4d小鼠子宮內(nèi)膜的蛋白表達主要定位在腔上皮細胞的游離面，深棕色陽性信號較強，腺上皮細胞和基質(zhì)細胞表達較弱(圖1D)。

A：早期胚泡 B：中期胚泡 C：晚期胚泡 D：妊娠4d子宮內(nèi)膜 圖1 TLR4蛋白在妊娠4d小鼠胚泡和子宮內(nèi)膜的表達(×200)

2.2 蛻膜細胞的純化和共培養(yǎng)著床模型的建立

蛻膜細胞培養(yǎng)18h即已貼壁，細胞呈圓形，24h后個別細胞開始伸出突起，呈成纖維細胞樣(圖2A)，培養(yǎng)9d后已全部匯合成層(圖2B)。傳代后，第三代蛻膜細胞用小鼠抗人波形蛋白抗體檢測蛻膜細胞純度，胞漿內(nèi)有棕黃色陽性顆粒、細胞核不著色者為蛻膜細胞，其純度均>95%(圖2C)。

小鼠胚泡與人蛻膜細胞共培養(yǎng)72h，掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)小鼠滋養(yǎng)層細胞的突起與人蛻膜細胞的突起相互接觸(圖3A)，并且可見滋養(yǎng)層細胞的突起伸入到蛻膜細胞下面(圖3B)，說明體外共培養(yǎng)著床模型建立成功。

A：培養(yǎng)24h人蛻膜細胞，個別已貼壁(×150) B：培養(yǎng)第9天人蛻膜細胞，已匯合成層(×150) C：波形蛋白免疫組織化學染色顯示蛻膜細胞(×200)圖2 體外培養(yǎng)人蛻膜細胞

A：小鼠滋養(yǎng)層細胞(T)與人蛻膜細胞(D)相互接觸 B：小鼠滋養(yǎng)層細胞(T)伸入人蛻膜細胞(D)下面圖3 共培養(yǎng)72h掃描電鏡觀察

2.3 抗TLR4抗體對胚泡滋養(yǎng)層細胞粘附和鋪展的影響

2.3.1對照組大多數(shù)胚泡于共培養(yǎng)12h脫去透明帶，共培養(yǎng)24h，孵出的胚泡粘附到蛻膜細胞上，其粘附率為90.32%，未粘附的則懸浮在培養(yǎng)液中，而且不能進一步生長(圖4A)；共培養(yǎng)48h，已粘附的胚泡滋養(yǎng)層細胞外延生長，鋪展率為83.87%；共培養(yǎng)72h滋養(yǎng)層細胞明顯向外擴展，平均擴展面積為(194.00×103) μm2(圖4B)。

A：共培養(yǎng)24h，胚泡粘附到蛻膜細胞上 B：共培養(yǎng)48h，胚泡滋養(yǎng)層細胞外延生長 圖4 對照組小鼠胚泡與人蛻膜細胞共培養(yǎng)(×150)

2.3.2實驗組胚泡能正常孵出、粘附，但其滋養(yǎng)層細胞的外延生長明顯受到抑制，各濃度組共培養(yǎng)72h的鋪展情況如圖5所示。3個不同濃度抗體組的粘附率分別與對照組相比無差異(P>0.05)，鋪展率100ng/ml組、200ng/ml組、400ng/ml組分別與對照組相比有差異(P<0.01)。共培養(yǎng)72h抗體組滋養(yǎng)層細胞的擴展面積以劑量依賴的方式受到抑制，均低于對照組(P<0.01)。見表1。

A：對照組，胚泡滋養(yǎng)層細胞明顯向外擴展 B：100ng/ml組，滋養(yǎng)層細胞外延生長，但擴展面積明顯減小 C：200ng/ml組，擴展面積較對照組明顯減小 D：400ng/ml組，局部滋養(yǎng)層細胞向外生長，擴展面積明顯減小 圖5 各組小鼠胚泡與人蛻膜細胞共培養(yǎng)72h(×150)

組別 粘附率(%) 鋪展率(%) 擴展面積(×103μm2) 對照組 87.4±2.383.5±3.3194.1±8.2100ng/ml組78.5±2.5 64.3±4.0*63.49±5.0**200ng/ml組 82.3±2.651.3±4.1**60.2±5.2**400ng/ml組 77.3±3.046.2±4.2**58.5±4.86**

*與對照組相比P<0.05**與對照組相比P<0.01

3 討論

正常妊娠可以看作是一種成功的同種半異體移植，母胎間存在著復雜的免疫應(yīng)答和免疫調(diào)節(jié)機制，母體的免疫功能處于一定的耐受狀態(tài)，是胚泡著床和維持妊娠的關(guān)鍵。胚泡著床是個復雜的生理過程。有研究證實，TLR4在胎盤滋養(yǎng)層細胞上有表達，其激活可誘導免疫應(yīng)答，有利于機體抵抗病原微生物感染或組織損傷，但是過強的免疫反應(yīng)也會帶來不利影響[7]。代盈盈等[8]研究發(fā)現(xiàn)，TLR4在妊娠期關(guān)中奶山羊子宮的分布和表達具有一定的規(guī)律，并可能參與子宮的免疫和分泌調(diào)節(jié)功能。

由于體內(nèi)研究無法人為地控制胚泡滋養(yǎng)層細胞的粘附和進一步的發(fā)育，難以準確地觀察胚泡著床各階段的變化以及各種相關(guān)因素間的協(xié)調(diào)作用。筆者參考Yoshimura等[5]建立的小鼠胚泡和人蛻膜細胞共培養(yǎng)的體外著床模型，與其不同的是，采用復合酶直接消化法，省去了Percoll密度梯度離心的復雜過程。根據(jù)早期胚胎對蛻膜組織無種屬要求的特點，用妊娠4d小鼠胚泡與人蛻膜細胞共培養(yǎng)，72h時掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)小鼠滋養(yǎng)層細胞的突起與人蛻膜細胞的突起相互接觸，并且可見滋養(yǎng)層細胞的突起伸入到蛻膜細胞下面，證明建立的體外共培養(yǎng)著床模型是成功的，而且用于研究胚泡滋養(yǎng)層細胞的粘附和鋪展情況可行。

為了研究TLR4在小鼠胚泡著床過程中的具體作用環(huán)節(jié)，在匯合成層的人蛻膜細胞中分別加入不同濃度抗TLR4抗體，與小鼠胚泡共培養(yǎng)，在倒置顯微鏡下觀察并統(tǒng)計粘附率、鋪展率及擴展面積。通過預實驗在TLR4缺少的耐受范圍內(nèi)選擇100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml 3個不同濃度。從實驗結(jié)果看，抗TLR4抗體不影響胚泡的粘附，但明顯抑制其鋪展，并且這種抑制作用呈劑量依賴關(guān)系。由此可見，在滋養(yǎng)層細胞粘附、遷移、分化過程中，可能是由于TLR4介導的細胞內(nèi)信號啟動時間不同，其調(diào)節(jié)著床的機理可能是通過激活NF-kB進而影響細胞的行為，如粘附、增殖、分化等[9-10]。TLR4能識別并快速啟動天然免疫反應(yīng)，釋放出各種炎癥因子，激活各種免疫細胞抵抗微生物入侵，以維持正常妊娠，這與筆者的前期研究是一致的，即著床前隨著卵巢類固醇激素分泌增加，子宮內(nèi)膜IL-8的表達逐漸增強，為子宮內(nèi)膜處于接受狀態(tài)以更好地完成與胚胎之間的識別、粘附做準備，IL-8可趨化更多的中性粒細胞移入基質(zhì)，分泌彈性蛋白酶，降解III型膠原蛋白，利于胚泡侵入子宮內(nèi)膜[11]。由此可見，在胚胎著床過程中，可能是通過TLR4 -NF-κB通路激發(fā)炎癥因子，如TNF-α、IL-2、IL-8等多種的炎性因子的釋放，使胚泡滋養(yǎng)層細胞的侵入性和子宮內(nèi)膜的接受性同步，保證著床順利進行。

研究結(jié)果表明：TLR4在著床前胚泡的內(nèi)細胞群和滋養(yǎng)層細胞均有表達，且不影響胚泡滋養(yǎng)層細胞的粘附，但對鋪展有促進作用，說明TLR4參與小鼠胚泡著床，且作用環(huán)節(jié)不同，胚泡粘附、鋪展以及滋養(yǎng)層細胞的進一步生長是由不同機制所介導。