李影，陸家睛，丁楊峰，易雪梅，于寧

（上海市皮膚病醫(yī)院，上海200443）

血清淀粉樣蛋白A（Serum amyloid A，SAA）是一種組織淀粉樣蛋白A的前體物質(zhì)，是常見急性期反應(yīng)蛋白的一種[1]。在炎癥、感染、組織損傷、腫瘤等疾病中均檢測到血清SAA升高。筆者的前期研究以及其他學(xué)者的研究均顯示尋常型銀屑病皮損中SAA mRNA和蛋白水平的表達(dá)都增加。但是，尚不明確SAA在銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和分化中發(fā)揮怎樣的作用。因此，本研究擬通過比較中和咪喹莫特銀屑病樣小鼠SAA前后皮損和相關(guān)細(xì)胞因子的變化，探討其在銀屑病發(fā)病中可能的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 5%咪喹莫特乳膏（艾達(dá)樂，美國3M公司），雌性BALB/c小鼠（購置上海動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心），PCR引物設(shè)計(jì)（大連寶生物工程有限公司），抗-SAA抗體（LS-C150247，購于美國LifeSpan Bio－Sciences公司），同型IgG（ab37373，購于美國Abcam公司）。

1.2 動(dòng)物 雌性BALB/c小鼠24只購置上海動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，6～8周齡，體質(zhì)量 18～20 g，飼養(yǎng)于天特定病原（SPF）級動(dòng)物飼養(yǎng)室，室溫20～24℃，照明時(shí)間12h/d，自由取食。所有小鼠背部剃毛，面積2cm×3cm，外涂5%咪喹莫特乳膏或凡士林62.5 mg，1次/d，連續(xù)6 d。分為4組，每組6只。1組：局部凡士林組腹腔注射控制性IgG，2組：局部凡士林組腹腔注射抗-SAA抗體，3組：局部咪喹莫特組腹腔注射IgG，4組：局部咪喹莫特組腹腔注射抗-SAA抗體。所有小鼠在2周后安樂死，并取背部皮膚進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.3 方法

1.3.1 組織病理 取背部皮損組織1 cm×1 cm，4%甲醛固定，脫水，石蠟包埋，切片并行HE染色。

1.3.2 免疫熒光 皮膚組織在冷凍前做好防凍處理，在含20%蔗糖溶液的磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中過夜孵育，然后在30%蔗糖溶液PBS中4℃過夜。在最佳的切割溫度時(shí)包埋劑包裹組織并凍結(jié)在液氮中。切割冷凍切片并收集在載玻片上，室溫下干燥，儲(chǔ)存在-80℃?zhèn)溆?。冰凍切片室溫放?5 min以防脫片，用 PBS清洗 3次，3～5 min/次，然后用含10%山羊血清的PBS室溫下封閉2 h，一抗4℃孵育過夜，PBS清洗3次，3～5 min/次，加入二抗37℃孵育 1 h，PBS 清洗 3 次，3～5 min/次，封片后熒光顯微鏡觀察結(jié)果并拍照。

1.3.3 皮損中核糖核酸（RNA）的提取和實(shí)時(shí)定量熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（Real-Time PCR）檢測皮損中SAA、白細(xì)胞介素（IL）-17A和趨化因子20（CCL20）的表達(dá) 引物設(shè)計(jì)合成SAA表達(dá)所需的引物序列上游為上游為5′-CGA AGC TTC TTT TCG TTC CTT-3′，下游為 5′-CAC CAT GGC CAA AGA ATC TC-3′；內(nèi)參 GAPDH 上游 5′-GGT CGG AGT CAA CGG ATT TG-3′；下游 5′-ATG AGC CCC AGC CTT CTC CAT-3′；IL-17A 5′-TTTAAC TCC CTT GGC GCA AAA-3′，5′-CTTTCC CTC CGC ATT GAC AC-3′；CCL20 5′-GCCTCT CGT ACA TAC AGA CGC-3′，5′-CCAGTT CTG CTT TGG ATC AGC-3′。選用兩管反應(yīng)體系對目的基因和內(nèi)參照進(jìn)行擴(kuò)增，建立總體積為20 μL的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系。取2 μL cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性30 s，95℃變性 5 s，58℃退火 34 s，60℃延伸 1 min，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后60℃延伸10 min，4℃保存。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。對尋常型銀屑病皮損、非皮損以及正常皮膚組織SAA與GAPDH比值進(jìn)行單因素方差分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示；采用卡方檢驗(yàn)比較SAA蛋白表達(dá)陽性率。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 咪喹莫特銀屑病樣小鼠皮損中SAA的表達(dá)①咪喹莫特銀屑病樣小鼠（IMQ）與凡士林對照小鼠（Vas）相比，皮損中SAA mRNA水平明顯升高；②用免疫熒光法檢測IMQ皮損中SAA的蛋白表達(dá)水平高于Vas，見圖1。

2.2 中和SAA后IMQ皮損的變化 中和SAA后IMQ與Vas相比，皮損的鱗屑減少，病理顯示表皮增生改善，皮損厚度明顯變薄，真皮浸潤的炎癥細(xì)胞減少，見圖2。

圖1 SAA在IMQ皮膚中的表達(dá)

2.3 中和SAA后IMQ皮損中IL-17A和CCL20的變化 中和SAA后IMQ與Vas相比，皮損中IL-17A和CCL20mRNA的表達(dá)減少，而對照組無變化，見圖3。

圖2 中和IMQ SAA后皮損的變化

圖3 中和IMQ SAA后皮損中IL-17A和CCL20 mRNA的變化

3 討論

血清淀粉樣蛋白是一種高度保守的急性期血漿蛋白，主要由肝臟合成。在急性炎癥中，肝臟相當(dāng)大比例的合成能力用于生產(chǎn)SAA。除了肝臟，SAA還在各種正常組織中如腎、乳腺和腸中合成，以及病變組織包括動(dòng)脈粥樣硬化斑塊、老年癡呆癥患者的腦組織以及患者的滑液組織等。筆者之前的研究以及Rooney等[3]的研究均表明，銀屑病表皮中SAA的表達(dá)增加[2-3]。SAA在感染和急性損傷時(shí)在周圍組織中誘導(dǎo)產(chǎn)生，同時(shí)其能促進(jìn)炎癥，部分是通過激發(fā)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生和招募顆粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞[4-5]。另外，SAA在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡中也發(fā)揮重要作用[6-7]。Couderc等[8]研究發(fā)現(xiàn)IL-17A誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生急性SAA是銀屑病發(fā)病機(jī)制之一。但是，SAA在銀屑病發(fā)病中的具體作用機(jī)制尚不清楚。

為了進(jìn)一步明確SAA在銀屑病發(fā)病中可能的作用，筆者使用IMQ。研究發(fā)現(xiàn)IMQ皮損中SAA的表達(dá)明顯增加，這與銀屑病患者皮損中SAA的表達(dá)升高一致，使用單克隆抗體中和SAA后，小鼠銀屑病樣皮損的厚度變薄，真皮浸潤的炎性細(xì)胞減少，同時(shí)銀屑病相關(guān)的炎性因子IL-17A和CCL20的表達(dá)水平也降低。提示中和SAA可減輕銀屑病相關(guān)的增生和炎癥。

SAA的表達(dá)是由促炎細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子（TNF）-α、IL-1β 和 IL-6 調(diào)控的[9]。近期研究發(fā)現(xiàn)，SAA在IL-23/Th17通路的活化過程中發(fā)揮一定作用。在外周血單核細(xì)胞中，SAA可誘導(dǎo)外周血單核細(xì)胞分泌IL-23[10]，而IL-23恰恰是Th17細(xì)胞分化和表型維持的關(guān)鍵細(xì)胞因子。IL-23/Th17通路是銀屑病發(fā)病的核心機(jī)制。推測，SAA可能通過影響IL-23分泌參與銀屑病發(fā)病，今后有待于進(jìn)一步在體外實(shí)驗(yàn)中去驗(yàn)證。

綜上所述，IMQ皮損中SAA的表達(dá)明顯增加，中和SAA可減輕銀屑病相關(guān)的增生和炎性因子的表達(dá)。因此，SAA在銀屑病的發(fā)病中起到重要作用，日后可作為銀屑病治療的一個(gè)靶點(diǎn)，為銀屑病患者提供新的選擇。