段 睿 鄧永平,2 劉曉蘭,2 鄭喜群 姜?dú)g笑 馬 瑞

(1． 齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006； 2． 黑龍江省玉米深加工理論與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 齊齊哈爾 161006； 3. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

木聚糖是植物細(xì)胞壁中最豐富的半纖維素，是自然界中僅次于纖維素的多糖[1]。木聚糖酶(EC 3.2.1.8)可將木聚糖水解成不同長(zhǎng)度的低聚木糖和D-木糖[2]，在工業(yè)上應(yīng)用廣泛，如用于紙漿改性[3]、生產(chǎn)生物燃料[4]、澄清果汁[5]、提升飼料質(zhì)量[6]以及生產(chǎn)木糖醇[7]等。2019年1月3日，澳新食品標(biāo)準(zhǔn)局發(fā)布70-19號(hào)通告，擬批準(zhǔn)來(lái)自里氏木霉轉(zhuǎn)基因菌株的木聚糖酶作為烘焙產(chǎn)品生產(chǎn)中的加工助劑[8]。

醋糟為釀造食醋后的廢棄物，年產(chǎn)量巨大。由于難降解，纖維含量高，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值低，在養(yǎng)殖業(yè)中很難達(dá)到像酒糟、豆渣等糟渣類(lèi)原料的高利用率；且由于酸度高，直接排放又易造成環(huán)境污染[9]。好食脈孢菌是一種子囊菌屬真菌，生長(zhǎng)速率快，為常見(jiàn)工業(yè)真菌黑曲霉和產(chǎn)黃青霉的2～3倍[10]。好食脈孢菌是FDA組織認(rèn)證的安全性真菌[11]，已見(jiàn)關(guān)于好食脈孢菌降解纖維類(lèi)底物富集蛋白質(zhì)及產(chǎn)纖維素酶等產(chǎn)物的報(bào)道[12-14]。課題組前期報(bào)道了好食脈孢菌發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的工藝[15-16]，原有工藝分別是采用液態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶，所使用的培養(yǎng)基配方較復(fù)雜，且生產(chǎn)成本有進(jìn)一步降低的空間。

由于固態(tài)發(fā)酵往往具有比液態(tài)發(fā)酵更高的產(chǎn)酶活力[17]，試驗(yàn)擬以富含纖維的釀醋廢棄物醋糟為發(fā)酵底物，經(jīng)好食脈孢菌固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶，對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為木聚糖酶提供安全、價(jià)廉的新來(lái)源，也為醋糟的利用提供新途徑，提高釀醋行業(yè)經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌種

好食脈孢菌(Neurosporasitophila)：齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院生物工程教研室菌種保藏室提供，分離自北方發(fā)酵豆制品。

1.1.2 材料與試劑

醋糟：齊齊哈爾市黑龍釀造有限責(zé)任公司；

木聚糖：美國(guó)Sigma公司；

其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器與設(shè)備

壓力蒸汽滅菌鍋：YXQ-SG46-280S型，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)；

高速冷凍離心機(jī)：Himac CF15RX型，日立(中國(guó))有限公司；

隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱：PYX-DHS·350-BS-Ⅱ型，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠(chǎng)；

分光光度計(jì)：TU-1810型，北京普析通用儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

(1) 斜面培養(yǎng)：培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)，配制方法參照文獻(xiàn)[18]。將4 ℃保存的好食脈孢菌菌株挑取至PDA斜面上，28 ℃培養(yǎng)3～5 d。

(2) 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)：在250 mL三角瓶中裝入5 g干醋糟，其他原料及配比根據(jù)試驗(yàn)確定。

1.2.2 氮源種類(lèi)對(duì)木聚糖酶活力的影響 培養(yǎng)基碳源為5 g醋糟，氮源分別為1%醋糟質(zhì)量的玉米蛋白粉、豆粕、干豆渣。料水比1∶3 (g/mL)，初始pH為培養(yǎng)基自然pH，滅菌后接入好食脈孢菌孢子懸液1 mL(含孢子量106個(gè)/mL)，28 ℃恒溫培養(yǎng)3 d后測(cè)定木聚糖酶活力。

1.2.3 干豆渣濃度對(duì)木聚糖酶活力的影響 調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中干豆渣濃度分別為醋糟質(zhì)量的0%，1%，2%，3%，4%，6%，8%，10%。將5 g干醋糟與上述不同濃度干豆渣加入到250 mL三角瓶中，料水比1∶3 (g/mL)，滅菌后接入好食脈孢菌孢子懸液1 mL(含孢子量106個(gè)/mL)，28 ℃ 培養(yǎng)3 d后測(cè)定木聚糖酶活力。

1.2.4 培養(yǎng)基料水比對(duì)木聚糖酶活力的影響 250 mL三角瓶中加入5 g醋糟和0.4 g干豆渣，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的料水比分別為1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5 (g/mL)，滅菌后接入好食脈孢菌孢子懸液1 mL(含孢子量106個(gè)/mL)，于28 ℃培養(yǎng)3 d后測(cè)定木聚糖酶活力。

1.2.5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)木聚糖酶活力的影響 250 mL三角瓶中加入5 g醋糟和0.4 g干豆渣，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的料水比分別為1∶3 (g/mL)，滅菌后接入好食脈孢菌孢子懸液1 mL (含孢子量106個(gè)/mL)，于28 ℃培養(yǎng)2，3，4，5 d后測(cè)定木聚糖酶活力。

1.2.6 正交試驗(yàn)優(yōu)化 利用L9(34)正交試驗(yàn)對(duì)好食脈孢菌產(chǎn)木聚糖酶的培養(yǎng)基初始pH、培養(yǎng)溫度和接種量進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.7 粗酶液的制備 培養(yǎng)結(jié)束后，向固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)物中加入100 mL生理鹽水，180 r/min浸提酶2 h。浸提結(jié)束后，過(guò)濾，在4 ℃、10 000 r/min離心10 min，得粗酶液。

1.2.8 酶活力的測(cè)定 參考GB/T 23874—2009方法，對(duì)酶促反應(yīng)的溫度和pH稍作修改。酶活力定義為在40 ℃、pH 6.0條件下，每分鐘水解木聚糖生成1 μmol還原糖所需酶的量為一個(gè)酶活力單位，用U/g表示。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，利用Excel 2003和SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的測(cè)定

由圖1可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)R2為0.998 4，可用于好食脈孢菌固態(tài)發(fā)酵醋糟產(chǎn)木聚糖酶活力的測(cè)定。

2.2 氮源種類(lèi)對(duì)木聚糖酶活力的影響

由圖2可知，當(dāng)以豆渣為氮源時(shí)，好食脈孢菌產(chǎn)木聚糖酶活力顯著高于玉米蛋白粉和豆粕的(P<0.05)，可能是豆渣中含有較高含量的膳食纖維(干基中約含60%)[19]，在發(fā)酵中起到了木聚糖酶誘導(dǎo)物的作用。

圖1 木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

圖2 氮源種類(lèi)對(duì)木聚糖活力的影響

2.3 豆渣濃度對(duì)木聚糖酶活力的影響

由圖3可知，隨著豆渣濃度的提高，酶活力顯著提高(P<0.05)，當(dāng)培養(yǎng)基中豆渣添加量為醋糟質(zhì)量的8%時(shí)，木聚糖酶活力最高；當(dāng)繼續(xù)增加豆渣濃度至10%時(shí)，培養(yǎng)基狀態(tài)較為黏稠，氧氣流通性變差，不利于好氧菌的生長(zhǎng)代謝，導(dǎo)致酶活力有所降低，與黑曲霉固態(tài)發(fā)酵豆渣生產(chǎn)纖維素酶及淀粉酶的研究結(jié)果[20]相似。因此，確定培養(yǎng)基中豆渣濃度為醋糟質(zhì)量的8%。

圖3 豆渣濃度對(duì)酶活力的影響

2.4 培養(yǎng)基料水比對(duì)木聚糖酶活力的影響

大多數(shù)絲狀真菌在固態(tài)基質(zhì)表面或內(nèi)部的生長(zhǎng)狀態(tài)取決于固態(tài)基質(zhì)的孔隙率[21]。培養(yǎng)基料水比對(duì)于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的溶解狀態(tài)，以及培養(yǎng)基的孔隙率均會(huì)有較大的影響，進(jìn)而對(duì)菌體生長(zhǎng)和活性物質(zhì)的積累產(chǎn)生一定的影響。由圖4可知，當(dāng)料水比為1∶3 (g/mL)時(shí)，木聚糖酶活力顯著高于其他料水比的(P<0.05)，達(dá)400.19 U/g；繼續(xù)加大培養(yǎng)基含水量會(huì)導(dǎo)致酶活力顯著降低(P<0.05)，因此，確定料水比為1∶3 (g/mL)。

2.5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)木聚糖酶活力的影響

由圖5可知，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，木聚糖酶活力呈先升高后逐漸降低的趨勢(shì)，培養(yǎng)至3 d時(shí)酶活力顯著增高(P<0.05)，之后無(wú)顯著性變化(P>0.05)，因此，確定培養(yǎng)時(shí)間為3 d。

圖4 培養(yǎng)基料水比對(duì)酶活力的影響

Figure 4 Effect of the solid-liquid ratio of culture media on enzyme activity

圖5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酶活力的影響

2.6 正交試驗(yàn)優(yōu)化

溫度、培養(yǎng)基pH和接種量是影響固態(tài)發(fā)酵效率的3個(gè)主要因子[22]。其中，溫度的影響尤為顯著，低溫培養(yǎng)減緩菌絲代謝速率，延長(zhǎng)生產(chǎn)周期，高溫培養(yǎng)易導(dǎo)致菌絲快速老化，抑制產(chǎn)物生成，適宜絲狀真菌產(chǎn)木聚糖酶的培養(yǎng)溫度大多在23～35 ℃[23]；培養(yǎng)基pH影響物質(zhì)的膜間運(yùn)輸，固態(tài)發(fā)酵過(guò)程主要研究培養(yǎng)基的初始pH值對(duì)產(chǎn)物的影響[24]，絲狀真菌的最佳生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的初始pH范圍大多在3.8～6.0[22]；接種量對(duì)于維持固態(tài)發(fā)酵中菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成的平衡具有重要影響，接種量過(guò)小會(huì)導(dǎo)致生物量過(guò)低，而接種量過(guò)大會(huì)導(dǎo)致不必要的真菌生長(zhǎng)和養(yǎng)分消耗，兩種情況均導(dǎo)致酶的產(chǎn)量低下[25]，固態(tài)發(fā)酵中采用的孢子接種量通常為105～107個(gè)孢子/g干基[22]。在前期預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上對(duì)好食脈孢菌發(fā)酵醋糟豆渣產(chǎn)木聚糖酶的培養(yǎng)基初始pH、培養(yǎng)溫度和接種量進(jìn)行正交試驗(yàn)分析，試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，試驗(yàn)結(jié)果及方差分析分別見(jiàn)表2、3。

由表2可知，好食脈孢菌固態(tài)發(fā)酵醋糟獲取木聚糖酶的最優(yōu)培養(yǎng)條件組合為：培養(yǎng)基初始pH 5.5、培養(yǎng)溫度28 ℃，接種量106個(gè)孢子/瓶，影響木聚糖酶活力的主次因素依次為培養(yǎng)溫度>初始pH值>接種量。

由表3可知，培養(yǎng)溫度對(duì)木聚糖酶活力有顯著影響(P<0.05)，初始pH、接種量對(duì)木聚糖酶活力無(wú)顯著影響。

最終確定好食脈孢菌發(fā)酵醋糟制備木聚糖酶的條件為：5 g醋糟與0.4 g干豆渣組合，料水比1∶3 (g/mL)，培養(yǎng)基初始pH 5.5，接種量106個(gè)孢子/瓶，28 ℃發(fā)酵3 d。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表2 L9(34) 試驗(yàn)結(jié)果

表3 木聚糖酶方差分析結(jié)果?

? *表示差異顯著(P<0.05)。

該條件下產(chǎn)酶活力為412.34 U/g，較優(yōu)化前(114.95 U/g)提高了約3.59倍。

3 結(jié)論

以釀造食醋下腳料醋糟為主要原料，利用好食脈孢菌固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶，得到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件：5 g醋糟與0.4 g干豆渣組合，料水比1∶3(g/mL)，培養(yǎng)基初始pH 5.5，接種量106個(gè)孢子/瓶，28 ℃ 發(fā)酵3 d。此條件下產(chǎn)木聚糖酶活力為412.34 U/g，較優(yōu)化前(114.95 U/g)提高了約3.59倍。

將醋糟廢物再利用，作為原料用于木聚糖酶的生產(chǎn)，有助于降低酶的生產(chǎn)成本，且醋糟中的半纖維素經(jīng)微生物降解可為木聚糖酶提供誘導(dǎo)物，有助于進(jìn)一步提高酶活力；同時(shí)，采用FDA認(rèn)證的安全菌種好食脈孢菌作為生產(chǎn)菌種，提高了木聚糖酶的安全性，可進(jìn)一步將其開(kāi)發(fā)為食品或飼料用酶制劑。木聚糖酶是一種誘導(dǎo)酶，在培養(yǎng)基中添加適量的生物或非生物誘導(dǎo)子對(duì)酶活力的提高具有一定的促進(jìn)作用，后續(xù)可進(jìn)一步研究誘導(dǎo)子對(duì)酶活力的影響，以期能更大幅度地提高木聚糖酶活力。