趙玉濱 穆秋霞 曲柳青 崔素萍

(黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江 大慶 163319)

美拉德反應(Maillardreaction，MR)是指食品中羰基化合物與氨基化合物發(fā)生的羰氨縮合反應[1]，又稱蛋白質或氨基酸的糖基化改性反應。美拉德反應不但可以改善食品的顏色和風味，而且其反應產物還具有抗氧化活性等，Hodge[2]認為美拉德反應會生成類黑精色素及其他高分子雜環(huán)化合物；孫常雁等[3]研究發(fā)現乳清蛋白肽的美拉德反應產物(MRPs)具有較強的總還原力、羥基自由基清除能力，且抗氧化活性隨著乳清蛋白肽美拉德反應產物質量濃度的增加而加強；劉蒙蒙[4]研究發(fā)現羅非魚皮膠原蛋白肽—葡萄糖MRPs抗氧化活性隨加熱時間的延長以及葡萄糖濃度增加而提高，且在堿性介質中產物活性較高；錢森和等[5]發(fā)現美拉德反應能夠有效增強芝麻多肽的抗氧化活性；項惠丹等[6]研究發(fā)現大豆分離蛋白與還原糖反應的MRPs抗氧化性均低于酪蛋白制備的MRPs，且兩種MRPs都有較強的抗氧化活性；Lertittikul等[7]在研究豬血紅蛋白和葡萄糖發(fā)生美拉德反應后，發(fā)現不同pH和加熱時間對MRPs的抗氧化能力都有顯著影響。Dong等[8]研究發(fā)現水解β-乳球蛋白與葡萄糖經美拉德反應后，MRPs的抗氧化能力顯著提高。

現有研究主要集中在某單一的反應物種類及反應條件對MRPs的抗氧化活性的影響，尚未見對反應物種類和反應條件對MRPs抗氧化活性的影響進行系統研究的報道。試驗擬將酪蛋白堿性蛋白酶的酶解產物與還原糖(葡萄糖、果糖、木糖)在不同反應pH、溫度和時間下建立糖基化反應體系，系統分析還原糖種類和反應條件對酪蛋白堿性蛋白酶的酶解產物糖基化產物的抗氧化活性的影響，并優(yōu)化反應條件，以期對今后的糖基化產物的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

酪蛋白：生化試劑，天津市大茂化學試劑廠；

2709堿性蛋白酶(2.0×105U/g)：生化試劑，北京鴻潤寶順科技有限公司；

葡萄糖、果糖、木糖：分析純，山東省龍力生物科技股份有限公司；

水楊酸：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

硫酸亞鐵、抗壞血酸、磷酸鹽緩沖液、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵、過氧化氫：分析純，天津市大茂化學試劑廠。

1.2 試驗儀器

紫外分光光度計：INESA-L5型，上海儀電分析儀器有限公司；

油浴鍋：DF-1型，金壇市虹盛儀器廠；

分析天平：BSA124S型，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；

水浴鍋：XMTD-204型，江蘇科析儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 酪蛋白堿性蛋白酶酶解產物的制備 將酪蛋白與蒸餾水配制成質量濃度為5%的溶液，然后用1 mol/L NaOH調pH至10，加入4 000 U/mL的堿性蛋白酶，在55 ℃酶解3 h，然后在90 ℃水浴10 min，即得酪蛋白酶解液，酶解液冷凍干燥備用。

1.3.2 糖基化改性的單因素試驗設計 以反應產物抗氧化活性為指標，進行單因素試驗條件的篩選。按糖與酪蛋白質量比為2∶1的比例，準確稱量2 g葡萄糖、木糖和果糖分別溶于酪蛋白堿性蛋白酶酶解產物溶液中，進行糖基化改性。待完全溶解后調pH為7.0，8.0，9.0，10.0，在110 ℃下反應2 h，確定最佳pH；調pH為10.0，在100，110，120，130 ℃恒溫下反應2 h，確定最佳反應溫度；調pH為10.0，在110 ℃恒溫下反應2，3，4，5 h，確定最佳反應時間。以上每個處理做3次重復。

1.3.3 正交試驗設計 在單因素試驗的基礎上，選取最優(yōu)還原糖、pH、溫度和時間，每個單因素確定3個較優(yōu)水平。采用三因素三水平正交試驗設計，以選擇最優(yōu)抗氧化的糖基化反應條件。

1.3.4 糖基化改性產物抗氧化活性的測定

(1) 清除羥基自由基活性：取50 μL糖基化反應產物(0.05 g/mL)，加水定容至2 mL，稀釋40倍，剩余步驟見文獻[9]。

(2) 還原力：取20 μL糖基化反應產物(0.05 g/mL)，加水定容至2 mL，稀釋100倍，剩余步驟見文獻[9]。

以未經處理的酪蛋白酶解液為對照樣品。

1.3.5 統計分析方法 用Microsoft Excel 2010及IBM SPSS Statistics 22.0進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 pH對糖基化產物羥基自由基清除率和還原力的影響

如表1所示，酶解產物與木糖、果糖的糖基化產物的羥基自由基清除能力在pH 7.0時最高，分別是38.63%和32.82%，高于對照且與其他試驗組差異顯著(P<0.05)。與葡萄糖的糖基化產物的羥基自由基清除能力隨pH的升高變化無規(guī)律，其中pH 7.0和pH 9.0之間差異不顯著(P>0.05)，而pH 9.0和 pH 10.0之間差異顯著(P<0.05)；在pH 10.0時清除率最高為25.67%，但仍低于對照，說明葡萄糖和酪蛋白酶解物糖基化產物的自由基清除率較低?？梢猿醪酵茢?，葡萄糖并不適于通過糖基化來提高酪蛋白水解產物抗氧化性。綜上所述，pH 7.0是木糖和果糖通過糖基化來提高酪蛋白水解產物抗氧化性的最佳pH。

表1pH對不同還原糖糖基化產物羥基自由基清除率的影響?

Table1EffectsofpHonthescavengingrateofhydroxylradicalsofdifferentreducingsugarsglycosylationproducts %

pH值葡萄糖木糖果糖7.020.87±0.49b38.63±3.70a32.82±1.46a8.023.13±3.09ab32.67±1.79b22.80±1.97b9.020.33±0.40b30.90±1.55b18.27±6.88b10.025.67±0.68a33.00±2.46b24.13±4.06b

? 對照樣品對羥基自由基清除率為(29.02±1.57)%；同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

從表2可以看出，酪蛋白酶解物與3種糖的糖基化產物的還原能力在試驗pH范圍內差異基本不顯著(P>0.05)(果糖在pH 7.0還原力偏低)。結合表1、2，pH 7.0是葡萄糖、木糖通過糖基化來提高酪蛋白水解產物抗氧化性的最佳pH。

表2pH對不同還原糖糖基化產物還原能力的影響?

Table2EffectsofpHonthereducingpowerofdifferentreducingsugarsglycosylationproducts

pH值葡萄糖木糖果糖7.00.71±0.01a0.75±0.20a0.46±0.05b8.00.93±0.45a0.87±0.16a0.67±0.13ab9.00.74±0.04a0.93±0.03a0.85±0.12a10.00.79±0.13a0.84±0.15a0.76±0.16a

? 對照樣品還原力0.63±0.03；同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 溫度對糖基化產物羥基自由基清除率和還原能力的影響

由表3、4可知，當溫度由100 ℃升至110 ℃時，酪蛋白酶解物與3種糖的糖基化產物羥基自由基清除率隨溫度的提高變化差異基本不顯著(除果糖略有差異外)，還原能力隨溫度的變化差異也不顯著；但均顯著低于120 ℃和130 ℃的結果(P>0.05)；3種糖的糖基化產物的羥基自由基清除率均低于對照，而還原能力低于或略大于對照。當溫度由120 ℃升至130 ℃時糖基化產物的羥基自由基清除率和還原力均高于對照。

章銀良等[10]研究溫度對酪蛋白—木糖美拉德反應產物抗氧化性的影響時，發(fā)現隨著溫度的升高，糖基化產物的羥基自由基清除能力和還原力都增強；劉海梅等[11]發(fā)現，隨著溫度的升高，葡萄糖—牡蠣酶解液的糖基化產物還原力增強，與試驗結果基本一致。綜上所述，120～130 ℃ 是葡萄糖、木糖和果糖通過糖基化來提高酪蛋白水解產物抗氧化性的最適溫度范圍。

表3溫度對不同還原糖糖基化產物羥基自由基清除率的影響?

Table3Effectsoftemperatureonhydroxylradicalscavengingrateofdifferentreducingsugarsglycosylationproducts %

溫度/℃葡萄糖木糖果糖10024.27±2.56c24.63±0.61b23.10±2.17b11021.87±1.20c25.63±4.29b27.47±1.54ab12041.77±1.11b58.77±7.19a48.27±1.89ab13076.40±4.59a67.17±10.03a56.27±31.52a

? 對照樣品對羥基自由基清除率為(29.02±1.57)%；同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

表4溫度對不同還原糖糖基化產物還原能力的影響?

Table4Effectsoftemperatureonthereducingpowerofdifferentreducingsugarsglycosylationproducts

溫度/℃葡萄糖木糖果糖1000.51±0.09b0.97±0.17c0.64±0.12b1100.54±0.15b0.56±0.14c0.64±0.17b1201.73±0.07a1.45±0.39b0.82±0.18ab1302.00±0.26a2.24±0.05a1.09±0.34a

? 對照樣品還原力0.63±0.03；同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 反應時間對糖基化產物羥基自由基清除率和還原能力的影響

反應時間對糖基化產物的羥基自由基清除率和還原能力的影響見表5、6。在反應前4 h內，酪蛋白酶解物與3種糖的糖基化產物的羥基自由基清除率和還原力基本隨反應時間的延長而增加；在4 h時，3種糖的糖基化產物的羥基自由基清除率和還原力均達到最高，且均顯著高于對照(P<0.05)。3種糖的糖基化產物，在反應3 h和 4 h時的羥基自由基清除率均高于對照，雖然果糖3 h的糖基化產物在檢測羥基自由基清除率是誤差較大，但是與還原力檢測結果一致，在反應2～3 h時都無顯著差異(P>0.05)；在反應2～5 h時的還原能力均高于對照。這是因為美拉德反應達到一定時間后，美拉德反應中間產物與氨基化合物進行醛基-氨基反應最終生成類黑精，類黑精具有抗氧化等活性。4 h后有所下降，可能是長時間加熱后導致還原性物質分解所致[12]。江連洲等[13]研究葡聚糖糖基化處理對綠豆蛋白抗氧化性影響時，發(fā)現反應開始時羥自由基清除能力迅速提升，之后隨著反應時間的延長呈現下降趨勢。趙晶等[14]發(fā)現，隨著時間的延長，酪蛋白酶解物與還原糖糖基化產物的還原力呈現先增加后降低的趨勢。兩者研究結果與試驗結果一致。綜上所述，反應時間4 h時，3種糖與酪蛋白酶解物的糖基化產物的羥基自由基清除率和還原能力最優(yōu)。

表5時間對不同還原糖糖基化產物羥基自由基清除率的影響

Table5Effectsoftimeonhydroxylradicalscavengingrateofdifferentreducingsugarsglycosylationproducts %

時間/h葡萄糖木糖果糖221.87±1.20b25.63±4.29c27.47±1.54b333.20±2.65ab59.60±2.93a54.60±36.47ab442.00±14.89a66.57±4.58a83.33±1.06a525.03±3.23b38.00±9.37b28.80±4.39b

? 對照樣品對羥基自由基清除率為(29.02±1.57)%；同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

表6時間對不同還原糖糖基化產物還原能力的影響?

Table6Effectsoftimeonthereducingpowerofdifferentreducingsugarsglycosylationproducts

時間/h葡萄糖木糖果糖20.80±0.16b0.83±0.19b0.90±0.13ab30.78±0.14b0.88±0.11b0.83±0.19b41.05±0.15a1.12±0.05a1.14±0.19a50.55±0.02b0.70±0.05b0.64±0.04b

? 對照樣品還原力0.63±0.03；同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.4 糖基化改性工藝的優(yōu)化

Wang等[15]研究發(fā)現乳清蛋白分離物與6種糖(葡萄糖、乳糖、木糖、果糖、蔗糖、麥芽糖)進行美拉德反應后，乳清蛋白分離物與木糖產生的糖基化產物抗氧化活性最高，其研究結果與試驗結果一致。所以正交試驗選用木糖與酪蛋白酶解物進行糖基化反應。正交試驗因素水平取值見表7，試驗設計及結果見表8。

由表8可知：影響糖基化產物羥基自由基清除率的主次因素為C>B>A。影響糖基化產物還原力的主次因素為B>C>A。酪蛋白酶解產物與木糖反應產生糖基化產物羥基自由基清除率和還原能力的優(yōu)化水平分別為A2B3C2和A2B2C2。

分別在溫度130 ℃、pH 7.5、時間4 h(A2B3C2)和溫度130 ℃、pH 7.0、時間4 h(A2B2C2)的條件下進行3次平行驗證實驗。結果表明，A2B3C2的羥基自由基清除率為82%，還原率為1.489；A2B2C2的羥基自由基清除率為71%，還原率為1.340。因此，確定抗氧化活性最強的反應條件為A2B3C2，即溫度130 ℃、pH 7.5、時間4 h。

3 結論

研究結果表明，通過糖基化改性可以提高酪蛋白酶解物的抗氧化性；酪蛋白酶解產物與木糖糖基化改性產物的抗氧化活性最強，最優(yōu)的抗氧化反應條件為溫度130 ℃、pH 7.5、時間4 h。試驗所涉及到的單糖種類較少，未來還可以利用其他糖類，例如半乳糖、麥芽糖、乳糖、淀粉、纖維素等進行深入研究，從而將酪蛋白水解物的抗氧化性提高，充分發(fā)揮酪蛋白水解物的抗氧化性在各類食品中的作用。

表7 正交試驗因素水平表

表8 正交試驗設計及結果分析表