王 迪 王 穎,2 張艷莉 劉淑婷 佐兆杭

(1. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319； 2. 國家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319)

蕓豆作為一類典型的低鈉高鉀鎂類食品，富含蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪、膳食纖維等人體必需的營養(yǎng)物質(zhì)[1-2]，還含有多種球蛋白、堿性皂體及活性肽等成分[3]，具有極高的食用及藥用價(jià)值。

酵素在中國、日本等亞洲國家風(fēng)靡。中國生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)協(xié)會(huì)發(fā)布的《酵素產(chǎn)品分類導(dǎo)則》標(biāo)準(zhǔn)中，將酵素定義為以動(dòng)物、植物和食用菌等為原料，經(jīng)微生物發(fā)酵制得的含有特定生物活性成分的可食用的酵素產(chǎn)品[4]。按照原料種類，可分為單一酵素和復(fù)合型酵素，生產(chǎn)原料多為蔬菜、水果、谷物及藥食同源類物質(zhì)，常通過自然發(fā)酵或人工接種兩種方式制成[5]。酵素作為營養(yǎng)機(jī)能食品生理功能突出，可通過調(diào)節(jié)內(nèi)源性膽固醇的合成，有效改善由于肥胖造成的脂肪組織的慢性和全身性低度炎癥[6-8]；還具有美白抗氧化[9]、消炎抗菌[10]、解酒護(hù)肝、清腸助消化等生理功能。秦松等[11]研究了混合菌種發(fā)酵的植物酵素顯著提高三酰甘油的活性，保護(hù)小鼠酒精性肝損傷，驗(yàn)證植物酵素的抗氧化性。Aruoma等[12]研究表明，木瓜酵素對(duì)經(jīng)H2O2氧化后造成DNA損傷的嗜鉻細(xì)胞瘤(PC12)細(xì)胞有調(diào)節(jié)作用，改善細(xì)胞形態(tài)并提高細(xì)胞生命力。戰(zhàn)偉偉等[13]對(duì)藍(lán)靛果椰子復(fù)合酵素發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后SOD酶活力為56.74 U/mL。中國目前尚未見蕓豆酵素復(fù)合發(fā)酵工藝優(yōu)化相關(guān)的研究。試驗(yàn)擬以黑龍江地區(qū)主產(chǎn)蕓豆為原料制備酵素，探討最優(yōu)發(fā)酵工藝，提高蕓豆附加值，深度挖掘生理功能，為植物酵素產(chǎn)品未來發(fā)展提供技術(shù)參考及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫花蕓豆：黑龍江省黑河市；

白砂糖：市售；

安琪牌活性干酵母：湖北安琪酵母股份有限公司；

植物乳桿菌(LP)、保加利亞乳桿菌(LB)：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)菌庫；

嗜酸乳桿菌(LA)、鼠李糖乳桿菌(LR)：中國工業(yè)微生物菌種保藏中心；

耐高溫α-淀粉酶(酶活力2.0×104U/g)、糖化酶(酶活力1.0×104U/g)：上海源葉生物科技有限公司；

SOD酶活力檢測(cè)試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平：BS224S型，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；

料理機(jī)：JYL-Y912型，九陽股份有限公司；

pH計(jì)：S220型，瑞典波通儀器公司；

電熱鼓風(fēng)干燥箱：DGG-9023A型，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；

可見分光光度計(jì)：V-5100B型，上海元析儀器有限公司；

數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋：HH-1S型，上海達(dá)洛科學(xué)儀器有限公司；

電熱恒溫培養(yǎng)箱：DRP-9082型，上海培因?qū)嶒?yàn)儀器有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌器：YXQ-30SII型，濟(jì)南捷島分析儀器有限公司；

臺(tái)式高速離心機(jī)：TG16-WS型，常州金勝儀器制造有限公司；

超凈工作臺(tái)：BCV-6S1型，浙江賽德儀器設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

蕓豆去皮清洗→打漿均質(zhì)→液化→糖化→離心→滅菌→接種→發(fā)酵→后發(fā)酵

↑

酵母菌、乳酸菌

1.3.2 菌種的活化與培養(yǎng) 取4 ℃下斜面保存的乳酸菌于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃下厭氧培養(yǎng)24 h，菌懸液待用?；钚愿山湍赣?0倍體積蒸餾水中溶解，30～35 ℃恒溫水浴鍋中活化30 min，菌液待用。

1.3.3 發(fā)酵基質(zhì)的制備 紫花蕓豆清洗后去皮，按1∶3(g/mL)料水比打漿。α-淀粉酶和糖化酶雙酶法進(jìn)行水解，通過前期預(yù)試驗(yàn)獲得液化和糖化條件。液化條件：α-淀粉酶添加量200 μL/100 mL、pH 6.0、酶解溫度97 ℃、時(shí)間20 min；糖化條件：加酶量200 μL/100 mL、pH 4.5、溫度60 ℃、時(shí)間30 min。酶解液于高速離心機(jī)中以1.0×104r/min離心15 min，得到蕓豆清汁。調(diào)清汁pH為5.0，添加8%白砂糖后滅菌備用。

1.3.4 接種與發(fā)酵

(1) 乳酸菌發(fā)酵：蕓豆清汁中接種3.0%不同種乳酸菌，37 ℃培養(yǎng)36 h，其他條件相同。

(2) 酵母菌發(fā)酵：30 mL蕓豆清汁裝于250 mL錐形瓶中，接種0.20%酵母菌，30 ℃條件下，180 r/min振蕩培養(yǎng)28 h。

(3) 復(fù)合發(fā)酵：按照1.3.7接種發(fā)酵蕓豆清汁，發(fā)酵后4 ℃低溫靜置使其產(chǎn)香。

1.3.5 酵母菌單獨(dú)發(fā)酵工藝優(yōu)化

(1) 發(fā)酵時(shí)間：在初始裝瓶量30 mL、pH 5.0、接種量0.20%的條件下，分別發(fā)酵8，16，24，32，40 h，測(cè)定發(fā)酵液SOD活力及酵母菌活菌數(shù)。

(2) 接種量：在初始裝瓶量30 mL、pH 5.0的條件下，分別接種0.10%，0.15%，0.20%，0.25%，0.30%酵母菌，發(fā)酵24 h后測(cè)定發(fā)酵液SOD活力及活菌數(shù)。

(3) 裝瓶量：在初始裝瓶量30 mL、pH 5.0、接種量0.20% 的條件下，250 mL錐形瓶中分別裝30，40，50，60，70 mL發(fā)酵液后接種酵母菌，發(fā)酵24 h后測(cè)定SOD活力及活菌數(shù)。

1.3.6 乳酸菌單獨(dú)發(fā)酵工藝優(yōu)化

(1) 發(fā)酵菌種及發(fā)酵時(shí)間：保證蕓豆清汁初始pH 5.0，接種3.0%不同乳酸菌菌液于蕓豆清汁中，37 ℃下分別發(fā)酵6，12，18，24，30，36 h，結(jié)束后測(cè)定發(fā)酵液中活菌數(shù)。

(2) 接種量：在初始pH 5.0、發(fā)酵溫度37 ℃條件下，分別接種1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%，3.5%菌液，LB、LA、LR和LP分別于發(fā)酵12，18，24，30 h后測(cè)定發(fā)酵液活菌數(shù)。

(3) 復(fù)配比例及發(fā)酵時(shí)間：在初始pH 5.0、發(fā)酵溫度37 ℃條件下，將上述兩種最優(yōu)乳酸菌分別按3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3比例接種，分別于發(fā)酵18，24，30 h時(shí)測(cè)定發(fā)酵液活菌數(shù)。

1.3.7 復(fù)合發(fā)酵 分別采用3種方式進(jìn)行復(fù)合發(fā)酵：① 先接種0.20%酵母菌，30 ℃條件下以180 r/min振蕩培養(yǎng)進(jìn)行預(yù)發(fā)酵，接種3.0%復(fù)合乳酸菌，37 ℃培養(yǎng)一定時(shí)間；② 先接種3.0%乳酸菌進(jìn)行預(yù)發(fā)酵，后接種0.20%酵母菌；③ 同時(shí)接種0.20%酵母菌和3.0%乳酸菌，37 ℃培養(yǎng)。以SOD活力為指標(biāo)，確定最佳發(fā)酵時(shí)間及接種順序。

1.3.8 測(cè)定項(xiàng)目及方法

(1) 乳酸菌活菌數(shù)：按GB 4789.35—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》執(zhí)行。

(2) 酵母菌菌體濃度：采用血球計(jì)數(shù)板法[14]。

(3) SOD酶活力：采用SOD酶活力試劑盒測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)操作，采用Origin 8.0、Design Expert軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌單獨(dú)發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.1.1 發(fā)酵時(shí)間的確定 酶活是衡量發(fā)酵體系是否達(dá)到成熟的指標(biāo)之一，是酵素行業(yè)廣泛測(cè)試的營養(yǎng)指標(biāo)[15]。因后期考察蕓豆酵素對(duì)肥胖方面的影響，故選用SOD活力作為參考指標(biāo)。由圖1可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，酵母菌活菌數(shù)顯著升高，24 h后趨于穩(wěn)定。SOD活力也呈現(xiàn)顯著上升至穩(wěn)定的趨勢(shì)。發(fā)酵液中的營養(yǎng)物質(zhì)是酵母菌發(fā)酵必備代謝基質(zhì)，其利用率顯著提高，未滿足酵母菌生長發(fā)酵條件，活菌數(shù)不再增多。因此確定發(fā)酵時(shí)間為24 h。

圖1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)SOD活力及活菌數(shù)的影響

2.1.2 接種量的確定 由圖2可知，隨著接種量的增加，發(fā)酵液中SOD活力及活菌數(shù)逐漸提高，當(dāng)接種量為0.20%時(shí)，SOD活力和酵母菌濃度分別達(dá)到78.82 U/mL和8.5×108CFU/mL，當(dāng)接種量超過0.20%時(shí)，活菌數(shù)及SOD活力顯著降低。酵母菌發(fā)酵主要利用碳源產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物，碳源缺乏阻礙酵母菌的繁殖與發(fā)酵，其生長速率低于衰亡速率，故酵母菌降低。因此確定酵母菌接種量為0.20%。

圖2 接種量對(duì)SOD活力及活菌數(shù)的影響

2.1.3 裝瓶量的確定 由圖3可知，SOD活力與活菌數(shù)隨裝瓶量的增加而顯著降低。酵母菌產(chǎn)酶與發(fā)酵液中溶氧量密切相關(guān)，隨著裝瓶量增加，體系中溶氧量減少，酵母菌生長受到限制，無氧條件下發(fā)酵產(chǎn)生乙醇。后期試驗(yàn)需在不同發(fā)酵時(shí)間多次取樣，且從經(jīng)濟(jì)角度考慮確定裝瓶量為30 mL。

圖3 裝瓶量對(duì)SOD活力及活菌數(shù)的影響

2.2 乳酸菌單獨(dú)發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.2.1 菌種的選擇 由圖4可知，LA活菌數(shù)在18 h時(shí)達(dá)到最大，可達(dá)1.86×1010CFU/mL，說明在發(fā)酵過程中其生長性能較好，此時(shí)高于其他3種乳酸菌活菌數(shù)。LB活菌數(shù)在12 h達(dá)最大，其遲緩期較短，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期較快。LP在30 h時(shí)得到最大活菌數(shù)，雖發(fā)酵時(shí)間最長，但高于其他3種乳酸菌。綜上，LB、LA、LR和LP最優(yōu)發(fā)酵時(shí)間分別為12，18，24，30 h。

圖4 不同菌種發(fā)酵過程中活菌數(shù)的變化

Figure 4 Changes in the number of viable bacteria during the fermentation of different strains

2.2.2 接種量的確定 由圖5可知，LB在1.5%的接種量時(shí)活菌數(shù)達(dá)到最高。當(dāng)接種量為2.0%時(shí)，LR活菌數(shù)最高，可達(dá)到14.3×109CFU/mL。LP和LA最佳接種量均為3.0%，且此時(shí)活菌數(shù)均高于LB和LR的最大活菌數(shù)。乳酸菌具有維持微生態(tài)平衡、提高生物效價(jià)及控制機(jī)體內(nèi)毒素等生理功能，含量越高其價(jià)值越高?？紤]乳酸菌之間可能存在共生作用，將具有較高活菌數(shù)的LA和LP按一定比例復(fù)配發(fā)酵，以期蕓豆酵素具備更高生理活性。乳酸菌接種量過多時(shí)活菌數(shù)下降，由于過量乳酸菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)酸抑制其本身的生長，取3.0%作為復(fù)配菌種發(fā)酵的接種量。

2.2.3 復(fù)配比例及發(fā)酵時(shí)間的確定 由圖6可知，LP與LA的比例為1∶3時(shí)，發(fā)酵18 h高于24 h和30 h的活菌數(shù)，此時(shí)復(fù)配菌種中LA所占比例更大，發(fā)酵18 h達(dá)到LA對(duì)數(shù)生長期，菌數(shù)積累。復(fù)配菌種發(fā)酵30 h時(shí)，LA進(jìn)入生長衰退期，此時(shí)LP適應(yīng)新環(huán)境后快速繁殖并積累發(fā)酵產(chǎn)物，生長速度快。LP和LA以1∶1比例復(fù)配，發(fā)酵24 h達(dá)最大活菌數(shù)，此時(shí)活菌數(shù)與發(fā)酵時(shí)間無關(guān)，可能是兩種菌間存在共生作用，相互利用產(chǎn)生有機(jī)酸及次生代謝產(chǎn)物[16]。因此最佳發(fā)酵時(shí)間24 h，復(fù)配比例為1∶1。

圖5 不同菌種的接種量對(duì)活菌數(shù)的影響

圖6 復(fù)配比例及發(fā)酵時(shí)間對(duì)活菌數(shù)的影響

2.3 復(fù)合發(fā)酵

與厭氧發(fā)酵的乳酸菌不同，酵母菌正常增殖發(fā)酵需要發(fā)酵液溶氧量充足[17]。酵母菌與乳酸菌發(fā)酵溫度存在差異，同時(shí)接種無法達(dá)到益生菌各自最優(yōu)條件。若先接種乳酸菌，酵母菌生長不良，發(fā)酵液感官評(píng)定較差。由于乳酸菌對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的利用率較高，酵母菌未利用碳源產(chǎn)生相關(guān)代謝產(chǎn)物，發(fā)酵液發(fā)酵不完全，且乳酸菌發(fā)酵時(shí)間過長，乳酸菌活力會(huì)自溶或衰亡。故選擇先接種酵母菌進(jìn)行預(yù)發(fā)酵，后接種乳酸菌的發(fā)酵方式。

由圖7可知，接種酵母菌24 h，發(fā)酵液SOD活力達(dá)最高并趨于穩(wěn)定，此時(shí)接種乳酸菌進(jìn)行后續(xù)發(fā)酵。24～48 h時(shí)SOD活力顯著升高，可達(dá)224.09 U/mL。酵母菌與乳酸菌之間存在互利共生作用。酵母菌產(chǎn)生出具有中鏈脂肪酸的甘露糖，促進(jìn)了乳酸菌的生長，而乳酸菌代謝產(chǎn)物乳糖又為酵母菌的生長提供了碳源。乳酸菌還可通過丙酮酸鹽裂解酶將丙酮酸鹽轉(zhuǎn)化為甲酸鹽，或者將檸檬酸鹽分解為乳酸鹽、乙酰甲基原醇、雙乙酰、2,3-丁二醇等芳香物質(zhì)，使發(fā)酵體系產(chǎn)香[18]。研究[19]表明，在高滲透壓、高溫、較低pH值等環(huán)境下，酵母菌會(huì)產(chǎn)生“交叉保護(hù)”，其實(shí)是酵母菌與乳酸菌共生體系中存在一種適應(yīng)反應(yīng)機(jī)制，這種機(jī)制一旦被激活，會(huì)促使酵母菌提升對(duì)外界環(huán)境的抵抗能力。故在發(fā)酵體系中，益生菌未產(chǎn)生自溶現(xiàn)象，二者緊密聯(lián)系，達(dá)到互利共生的狀態(tài)，蕓豆發(fā)酵液形成穩(wěn)定的平衡體系。

圖7 復(fù)合發(fā)酵對(duì)SOD活力的影響

3 結(jié)論

試驗(yàn)以紫花蕓豆為發(fā)酵原料，經(jīng)酵母菌、復(fù)合乳酸菌多菌種共同發(fā)酵得到SOD活力較高的蕓豆酵素產(chǎn)品。酵母菌單獨(dú)發(fā)酵情況下發(fā)酵時(shí)間、接種量及裝瓶量的試驗(yàn)條件優(yōu)化，并優(yōu)化乳酸菌發(fā)酵菌種、接種量及復(fù)配比例和發(fā)酵時(shí)間，確定植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌以1∶1比例復(fù)合發(fā)酵。采用先酵母菌進(jìn)行預(yù)發(fā)酵后接種乳酸菌的發(fā)酵順序，最優(yōu)發(fā)酵條件為：在pH 5.0、接種量0.20%、裝瓶量30 mL(250 mL)的條件下，30 ℃振蕩培養(yǎng)24 h；再接種1.5%植物乳桿菌和1.5%嗜酸乳桿菌，37 ℃培養(yǎng)24 h；4 ℃低溫靜置24 h使酵素產(chǎn)香。在此條件下，SOD活力可達(dá)224.09 U/mL，益生菌發(fā)酵產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物，反應(yīng)體系走向成熟。后期將對(duì)蕓豆酵素功能特性進(jìn)行研究，以探究其生理功能。