秦 臻 李正淼 秦 漢 姜亨波 陳 微 石運(yùn)芝

1.口腔醫(yī)學(xué)院； 2.動(dòng)脈粥樣硬化研究所，山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)，山東 泰安 271016

牙菌斑(dental plaque)是在所有人口腔中都存在的一種由口腔微生物群落組成的生物膜結(jié)構(gòu)[1]。人類口腔中存在著結(jié)構(gòu)復(fù)雜的微生物菌群，它們?cè)谒拗骺谇唤】禒顩r方面起著重要作用?？谇患膊?如齲齒，牙齦炎，牙周炎等)是由于牙菌斑中的微生物之間以及微生物與宿主之間的生態(tài)平衡被打破而發(fā)展成的。了解口腔牙菌斑中微生物的種類對(duì)恢復(fù)口腔內(nèi)生態(tài)平衡，治療與預(yù)防口腔疾病有重大意義[2-3]?？谇患膊〉难芯看蠖嘁?dòng)物模型才能進(jìn)行，由于動(dòng)物與人類的口腔始終存在一定的差別以及口腔疾病致病機(jī)制的復(fù)雜性，很難確定一個(gè)完美的動(dòng)物模型來完全模擬人類口腔疾病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律。而且由于不同實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的差別，所建造的動(dòng)物模型中牙菌斑的微生物組成會(huì)有差別，這些都會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響[4]。有研究表明，小型豬、大鼠、人類口腔內(nèi)微生物構(gòu)成比之間存在差異[5]。因此，在進(jìn)行口腔疾病相關(guān)研究之前，研究者不僅要熟悉人類口腔牙菌斑中微生物種類，更要明確實(shí)驗(yàn)動(dòng)物口腔牙菌斑中微生物種類。通過分離、培養(yǎng)、鑒定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物口腔牙菌斑中微生物種類，與人類作對(duì)比，可以對(duì)有關(guān)口腔疾病防治的相關(guān)研究提出更準(zhǔn)確的意見與建議。相比其他動(dòng)物，鼠科的動(dòng)物較溫順，飼養(yǎng)成本和生長(zhǎng)所需空間小，并且有大量學(xué)者采用鼠科動(dòng)物進(jìn)行口腔相關(guān)疾病的研究，曾有研究者在倉鼠口內(nèi)提取到雙歧桿菌[6]。所以此次實(shí)驗(yàn)我們主要在健康成年Wistar雄性大鼠口內(nèi)建立菌斑模型，對(duì)其牙菌斑細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)與鑒定，為選擇適合人類口腔微生物和疾病研究的模型動(dòng)物，建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物菌斑模型、齲病模型，研究齲病防治方法等提供基礎(chǔ)性資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康成年Wistar雄性大鼠24只，質(zhì)量(220±20)g，購自濟(jì)南朋悅公司，常規(guī)飼養(yǎng)，通風(fēng)清潔，光照12 h，適應(yīng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

腦心浸出液肉湯(brain heart infusion broth，BHI；青島高科園海博生物技術(shù)有限公司)、哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基(濟(jì)南百博生物技術(shù)股份有限公司)、MSA培養(yǎng)基(青島高科園海博生物技術(shù)有限公司)、TPY瓊脂培養(yǎng)基(青島高科園海博生物技術(shù)有限公司)、菌斑染色劑-堿性品紅(日進(jìn)齒科材料有限公司)、結(jié)晶紫染液、碘液、95%酒精、稀釋復(fù)紅、香柏油、Trans2K DNA Marker、Mix、上游與下游引物(表1)、ddH2O、BIOWEST REGULAR AGAROSE G-10(上海微科生物技術(shù)有限公司)、50×TAE緩沖液(北京索萊寶科技有限公司)、核酸凝膠染料試劑gelred(北京索萊寶科技有限公司)和瓊脂糖等。

表1 上下游引物

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1菌斑模型的建立

用普通顆粒飼料和60%高糖水飼喂健康成年Wistar雄性大鼠。20天后，用菌斑染色劑檢測(cè)大鼠磨牙舌面與牙合面菌斑的形成情況。

1.3.2牙菌斑的采集與細(xì)菌的分離鑒定

用無菌棉棒在牙合面窩溝點(diǎn)隙采集牙菌斑，涂布在MSA培養(yǎng)基與TPY瓊脂培養(yǎng)基上，37℃ 恒溫箱(天津泰斯特儀器有限公司101-3AB型)中培養(yǎng)48 h，觀察菌落形態(tài)。

用接種環(huán)分別挑取MSA培養(yǎng)基與TPY瓊脂培養(yǎng)基中的優(yōu)勢(shì)菌落，接種在哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基(以下稱血瓊脂培養(yǎng)基)上進(jìn)行純培養(yǎng)，37℃恒溫箱培養(yǎng)48 h，觀察菌落形態(tài)。隨后將血瓊脂培養(yǎng)基上的菌落接種于腦心浸出液肉湯(以下稱BHI增菌液)，37℃BS-1E恒溫震蕩培養(yǎng)箱(常州市金壇友聯(lián)儀器研究所)中增菌48 h。

1.3.3革蘭氏染色

在潔凈的玻片中間加生理鹽水1滴。接種環(huán)燒灼滅菌后，取血瓊脂培養(yǎng)基中細(xì)菌培養(yǎng)物與生理鹽水混勻，涂成直徑1 cm的均勻薄膜涂片。然后按照順序滴加結(jié)晶紫染液、革蘭碘液、95%酒精、稀釋復(fù)紅染液，每?jī)蓚€(gè)步驟之間需用水沖洗玻片。最后晾干，滴加香柏油，用油鏡觀察細(xì)菌形態(tài)。燒去接種環(huán)上多余的菌體后，再取另一細(xì)菌培養(yǎng)物重復(fù)上述步驟[8]。

1.3.416S rRNA基因擴(kuò)增和測(cè)序

取增菌液500 μL加入離心管內(nèi)，12 000 r/min離心1 min，棄去上清液；加入500 μL dd H2O洗滌2次，離心后棄掉上清液。隨后離心管內(nèi)加入40 μL dd H2O，混勻，98℃水浴加熱30 min，冷卻，瞬時(shí)離心，上清液中即含細(xì)菌DNA，可用于16S rRNA基因擴(kuò)增。

PCR擴(kuò)增的總反應(yīng)體積為25 μL，依次加入Mix 12.5 μL，dd H2O 10.5 μL，DNA提取液1 μL，引物27F 0.5 μL，引物1492R 0.5 μL，瞬時(shí)離心混勻。在Applied BiosystemsTMVeritiTM96-Well Thermal Cycler 熱循環(huán)儀中，反應(yīng)按95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸90 s，循環(huán)30次，最后72℃延伸10 min[9]。

將擴(kuò)增產(chǎn)物一部分在DYY-6D電泳儀(北京市六一儀器廠)中進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成像儀(BIO RAD UNIVERSAL HOOD)觀察，拍照，記錄結(jié)果；另一部分送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中使用BLAST軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析。16S rRNA序列同源性大于99%提示屬于同一種細(xì)菌。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 牙菌斑形成情況

在大鼠磨牙牙合 面窩溝內(nèi)可見指示劑著色，表明此處有菌斑形成,見圖1。

圖1 大鼠牙合面菌斑染色結(jié)果

2.2 細(xì)菌在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況

在血瓊脂、BHI和MSA培養(yǎng)基中共分離得到3種不同菌落形態(tài)的細(xì)菌，分別標(biāo)記為1、2和3號(hào)。

1號(hào)細(xì)菌在血瓊脂培養(yǎng)基、BHI培養(yǎng)基與MSA培養(yǎng)基上呈完整的乳膏樣或白色的圓形菌落，面積較大，表面光滑濕潤(rùn)，邊緣整齊，見圖2(A)、(D)、(G)。細(xì)菌在血瓊脂培養(yǎng)基中不溶血且生長(zhǎng)情況最好，BHI培養(yǎng)基和MSA培養(yǎng)基的菌落直徑明顯小于血瓊脂培養(yǎng)基，BHI培養(yǎng)基的菌落直徑明顯小于MSA培養(yǎng)基,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

2號(hào)細(xì)菌在BHI與MSA培養(yǎng)基上呈半透明狀，是圓形突起、表面粗糙、邊緣整齊的針尖樣大小菌落，見圖2(E)、(H)；在血瓊脂培養(yǎng)基中為直徑1 mm大小半透明狀菌落，不溶血且生長(zhǎng)情況最好，見圖2(B)。菌落直徑統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，BHI培養(yǎng)基和MSA培養(yǎng)基的菌落直徑明顯小于血瓊脂培養(yǎng)基，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

3號(hào)細(xì)菌在血瓊脂培養(yǎng)基與BHI培養(yǎng)基上表現(xiàn)為直徑1～2 mm的圓形灰白色菌落，表面光滑濕潤(rùn)，邊緣整齊，見圖2(C)、(F)；在MSA培養(yǎng)基上，呈直徑3～4 mm的半透明狀菌落，生長(zhǎng)情況最好，見圖2(I)。菌落直徑統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，血瓊脂培養(yǎng)基和BHI培養(yǎng)基的菌落直徑明顯小于MSA培養(yǎng)基，BHI培養(yǎng)基的菌落直徑明顯小于血瓊脂培養(yǎng)基，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 細(xì)菌在不同培養(yǎng)基上的菌落直徑(mm)

注：同一列中上標(biāo)不同小寫字母表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。

A.血瓊脂培養(yǎng)基上1號(hào)細(xì)菌生長(zhǎng)情況；B.血瓊脂培養(yǎng)基上2號(hào)細(xì)菌生長(zhǎng)情況；C.血瓊脂培養(yǎng)基上3號(hào)細(xì)菌生長(zhǎng)情況；D.BHI培養(yǎng)基上1號(hào)細(xì)菌生長(zhǎng)情況；E.BHI培養(yǎng)基上2號(hào)細(xì)菌生長(zhǎng)情況；F.BHI培養(yǎng)基上3號(hào)細(xì)菌生長(zhǎng)情況；G.MSA培養(yǎng)基上1號(hào)菌落生長(zhǎng)情況；H.MSA培養(yǎng)基上2號(hào)菌落生長(zhǎng)情況；I.MSA培養(yǎng)基上3號(hào)菌落生長(zhǎng)情況

圖2 細(xì)菌在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況

2.3 革蘭氏染色結(jié)果

革蘭氏染色結(jié)果顯示3種細(xì)菌染色后都為紫色，提示它們都為革蘭氏陽性菌。1號(hào)細(xì)菌為圓形或橢圓形，成對(duì)或短鏈?zhǔn)缴L(zhǎng)，見圖3(A)。2號(hào)細(xì)菌呈細(xì)長(zhǎng)桿狀，中等大小，多數(shù)單個(gè)分布，少數(shù)成對(duì)分布,見圖3(B)。3號(hào)細(xì)菌為圓形或橢圓形，鏈狀排列，長(zhǎng)短不一,見圖3(C)。

A.1號(hào)細(xì)菌；B.2號(hào)細(xì)菌；C.3號(hào)細(xì)菌

2.4 16S rRNA基因擴(kuò)增和測(cè)序

16S rRNA基因擴(kuò)增顯示3種細(xì)菌都出現(xiàn)了1500 bp左右的目標(biāo)條帶，無雜帶，特異性較好。1號(hào)細(xì)菌亮度最大，其次是3號(hào)細(xì)菌，2號(hào)細(xì)菌亮度較淡，見圖4。

序列比對(duì)結(jié)果顯示1號(hào)細(xì)菌為糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)，2號(hào)細(xì)菌為發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)，3號(hào)細(xì)菌為唾液鏈球菌(Streptococcussalivarius)。

圖4 3種細(xì)菌產(chǎn)物凝膠電泳圖

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)成功建立了菌斑模型，見圖1。從中分離到糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)，發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)和唾液鏈球菌(Streptococcussalivarius)。大量的研究顯示這3種細(xì)菌同時(shí)存在于人類口腔中[10]。這3種細(xì)菌都屬于厚壁菌門(Firmicutes)、芽胞桿菌綱(Bacillales)、乳桿菌目(Lactobacillales)。糞腸球菌屬于腸球菌科(Enterococcaceae)、腸球菌屬(Enterococcus)，在難治性根尖周炎中，糞腸球菌的檢出率高達(dá)77%[11]，一般以單一感染為主[12]。本實(shí)驗(yàn)中，大鼠的牙菌斑中檢測(cè)出糞腸球菌為主要優(yōu)勢(shì)菌之一。大多數(shù)根尖周炎繼發(fā)于牙髓疾病，而牙髓疾病是由于齲病、外傷等波及牙本質(zhì)深層，刺激通過牙本質(zhì)小管傳入牙髓，引起牙髓組織炎癥或修復(fù)反應(yīng)[13]。究其源頭有一部分是由于齲病引起難治性根尖周炎，而上世紀(jì)50年代Orland和Fifzgerald 等就認(rèn)識(shí)到，齲病無菌斑不成立[14]，菌斑中的糞腸球菌會(huì)通過牙本質(zhì)小管進(jìn)入牙髓，繼而到達(dá)根尖孔，接觸到血管、淋巴組織等。這種途徑進(jìn)入的糞腸球菌甚至?xí)鹁Y，隨著血液組織到達(dá)臟器，從而引起或加速臟器的病變。發(fā)酵乳桿菌屬于乳桿菌科(Lactobacillaceae)、乳桿菌屬(Lactobacillus)，發(fā)酵乳桿菌是口腔內(nèi)的正常菌群，該菌可以發(fā)酵多種糖，具有較強(qiáng)的產(chǎn)酸耐酸能力，在齲洞與牙菌斑中常見，只是數(shù)量少，黏附能力較弱。發(fā)酵乳桿菌是否能致齲存在著不同的看法，它在齲損的產(chǎn)生中不如在齲損的發(fā)展中起到的作用大，在齲損的發(fā)展中它本身的數(shù)量會(huì)增加，并且可以促進(jìn)損壞速度以及病變區(qū)其他致齲菌的黏附能力。唾液鏈球菌屬于鏈球菌科(Streptocpccaceae)、鏈球菌屬(Streptocpccus)。唾液鏈球菌在健康人體口腔中占重要地位，它可利用蔗糖合成水溶性果聚糖從而致齲。曾有實(shí)驗(yàn)證實(shí)此菌種可對(duì)動(dòng)物致齲，對(duì)人類卻無致齲性[15]。唾液鏈球菌對(duì)人體而言是一種益生菌，可以抑制多種微生物的活性，減少有害菌群在口腔和呼吸道的定植。唾液鏈球菌對(duì)口臭、口腔念珠菌病、中耳炎等的預(yù)防和治療有良好的效果。雖然Wistar大鼠與人類口腔組成相似，但也有研究表明，Wistar大鼠與人類口腔菌群結(jié)構(gòu)門水平、屬水平各不相同，在菌群豐富度與相似程度上也不相同[16]。本實(shí)驗(yàn)在Wistar大鼠的喂養(yǎng)食物與時(shí)間、性別、菌斑獲取牙位等方面與上述研究可能不同，使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致。

綜上所述，本次實(shí)驗(yàn)在Wistar大鼠建立了菌斑模型，分離出了3種細(xì)菌，且Wistar大鼠產(chǎn)生齲病，提示它們可能對(duì)齲病的發(fā)生發(fā)展起到一定程度的作用，在人體中，可能也會(huì)有相似的作用。這可以為建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物菌斑模型、齲病模型，研究齲病防治方法等提供基礎(chǔ)性資料。Wistar大鼠的口腔牙菌斑微生物組成與人類相似，提示該模型動(dòng)物可以為口腔微生物和口腔疾病的研究提供參考。